Téma P 02: Diagnostika streptokoků K nastudování: Streptococcus (z učebnic, internetu…) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace, Neutralizace Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 6 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol č. 1 Kataláza – úkol 2a Slanetz-Bartley 2b Kulti- vace (krevní agar) Úkol č. 3 Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) Úkol 4b: Streptotest 16 (jen ústní strep.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol č. 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a určete, který z nich není grampozitivním kokem. Nátěry jednotlivých kmenů označte na sklíčku pomocí dermografu příslušným písmenem. Výsledky zapište do tabulky. U kmenů, které nejsou G+ koky, proškrtněte zbylou část tabulky. Úkol č. 2: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalasový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalasový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou katalasa pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Zapište do tabulky. b) Růst na Slantetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Roste však jen jeden. Tento kmen je enterokok, a není tedy streptokok. Zapište výsledek do tabulky. Úkol č. 3 Kultivace na krevním agaru Na miskách s krevním agarem máte opět všechny kmeny. Ty, které jste vyloučili v úkolech 1 a 2, nemusíte popisovat, pro porovnání se však na ně podívejte. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky. Nyní zapište do tabulky „dílčí závěr“. Ke každému z kmenů K až S zapište „NENÍ STR“ (není streptokok) „HEMOL STR“ (částečná či úplná hemolýza) nebo „VIRID STR“ (streptokok s viridací) Úkol č. 4 Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledek zakreslete a zapište do tabulky (tam stačí ve formě + / –) b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka U kmene, který jste v předchozím úkolu určili jako „ústního“ streptokoka, druhově vyhodnoťte biochemický mikrotest, využívajíce postupů, které znáte z jarního semestru. Zkum. První řádek s osmi jamkami Druhý řádek s osmi jamkami VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace Streptococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol č. 5 Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s betahemolýzou (části a, b, c); poslední část pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je proužkový test, podobný oxidázovému. Při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Také tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je Streptococcus agalactiae i non-A-non-B streptokoky. Poznámka: Někdejší bacitracinový test se dříve používal místo PYR-testu. Jeho princip je shodný s principem optochinového testu, jen s jiným antibiotikem. Pro nedostatečnou specificitu byl již téměř opuštěn. Vyplňte následující tabulku, včetně zakreslení výsledku PYR testu u všech tří testovaných kmenů. Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých objevitelů. Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-haemolyzin a kmenem S. agalactiae strain. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku (na následující stránce): c) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněne si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, a zapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). A B C E F G Úkol č. 6 Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Vyhodnoťte testy citlivosti (difusní diskové testy) na antibiotika u těch kmenů streptokoků, které považujete za patogeny či možné patogeny; předpokládejme pro jednoduchost, že se jedná o kmeny z horních cest dýchacích. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivost v mm. Na kartičce jsou napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Dubiózní jsou zóny, jejichž průměr právě odpovídá referenční zóně. Kmen Antibiotikum (celý název) Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Úkol č. 7 Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a séra 1 až 5. Určete titry a interpretujte z hlediska rizika. (Přesné provedení bylo popsáno v jarním semestru při probírání neutralizace). Výsledek: Interpretace výsledku: Kontrolní otázky: 1. Který streptokok je uspořádán ve dvojicích a jaký tvar jeho koky mají? 2. Který streptokok má pozitivní PYR test? A který celý rod G+ koků jej má pozitivní? 3. Provádí se druhové určení ústních streptokoků rutinně? Kdy má význam? 4. Proč se optochinový test (ale i normální difusní diskové testy) provádí na agaru MH s krví a ne na běžném MH agaru? 5. Lze použít CAMP test v diagnostice zlatého stafylokoka? Zdůvodněte. 6. Proč se u betahemolytických streptokoků k druhovému určení zpravidla nevyužívá biochemických testů? 7. U kterých streptokoků připadají v úvahu pozdní následky a o jaké následky se především jedná? 8. Které streptokoky způsobují infekce s kožními projevy? O jaké infekce jde?