Téma P04: Diagnostika enterobakterií a bakteriálních původců gastrointestinálních infekcí Ke studiu: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Campylobacter, Helicobacter (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, antigenní analýza Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Kulti- vace (KA a Endova půda) Úkol 2 Velikost KA Barva KA Jiné KA Velikost Endo Barva Endo Jiné Endo Hajnova půda Úkol 3a Oxidázový test Úkol 3b DÍLČÍ ZÁVĚR Další půdy Úkol 4a XLD agar MAL agar CIN agar EnteroTest 16 (Úkol 4b) Antigenní analýza (Úkoly 5a a 5b) KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a vepište výsledky do tabulky. Kmeny, které nejsou G– tyčinky, nebudou zkoumány v úkolech 3 až 5 (ale v Úkolu 2 pro srovnání s ostatními ano). Úkol 2: Kultivace na krevním agaru a Endově půdě Standardním způsobem popište kolonie všech kmenů na krevním agaru a Endově půdě. Pokud kmen na půdě neroste, políčko proškrtněte. Bakterie, které na žádné z obou půd nerostou a morfologicky se jeví jako zahnuté gramnegativní tyčinky, mohou být kampylobakter. Gramnegativní tyčinka, která na žádné půdě neroste, ale mikroskopicky není zahnutá, se bude probírat v příštím praktiku. Pro srovnání popište i kmen, který se morfologicky jevil jako grampozitivní kok. U stolu každý obarví jeden kmen, výsledky si vzájemně předveďte. Nátěry označte na sklíčku pomocí dermografu příslušným písmenem. Úkol 3: Skupinová diagnostika nejvýznamnějších na Endu rostoucích G– tyčinek a) Odečtení zkoušky na šikmém agaru podle Hajny Agar podle Hajny je kombinovaná diagnostická půda. V tomto úkolu nám však půjde zejména o odlišení biochemicky neaktivních, glukosu ani laktosu nefermentujících a sirovodík netvořících tyčinek – gramnegativních nefermentujících bakterií. Na Hajnově půdě jsou naočkovány všechny kmeny rostoucí na Endu. Prohlédněte výsledek. Tam, kde půda zůstala v celém rozsahu červená, jde o biochemicky neaktivní kmen – zřejmě tedy o gramnegativní nefermentující tyčinku. Tento kmen nebude testován v úkolech číslo 4 a 5. b) Oxidázový test Učitel demonstračně provede oxidázový test u všech G– bakterií rostoucích na Endu. Oxidázapozitivní jsou zástupci čeledi Vibrionaceae a některé gramnegativní nefermentující tyčinky; enterobakterie (s výjimkou plesiomonád) oxidasu nemají. Po splnění úkolů 1 až 3 sepište DÍLČÍ ZÁVĚR. Které bakterie jsou enterobakterie? Další úkoly budou prováděny právě jen s enterobakteriemi. Úkol 4: Rodové a druhové určení enterobakterií kultivačními a biochemickými testy a) Kultivační průkaz enterobakterií na dalších půdách Už jste viděli výsledky kultivace na KA a Endu. Nyní si prohlédněte ještě misky s agary CIN, XLD a MAL. Popište krátce kolonie enterobakterií na těchto půdách (vyplňte do tabulky). b) Biochemický průkaz enterobakterií Vyhodnoťte ENTEROtest 16, který byl inkubován od předchozího dne. Zkontrolujte, zda výsledky souhlasí i s jinými testy, které jste již provedli; např. tvorba H[2]S se projeví i na Hajnově půdě, yersinie rostou v typických drobných koloniích na půdě CIN, salmonely mají bledé kolonie s černým středem na půdách XLD a MAL. U salmonel napište pouze Salmonella sp., jako % pravděpodobnosti uveďte součet procent všech salmonel uvedených u příslušného kódu, a index typičnosti vezměte z prvního kmene. ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index Úkol č. 5 Antigenní analýza v diagnostice enterobakterií Antigenní analýzu budeme provádět pouze u těch bakteriálních kmenů, kde se provádí rutinně. Antigenní analýza je u enterobaktérií prováděna především ze dvou důvodů: (a) odlišení antigenních typů se zvýšenou virulencí – především u E. coli k odlišení EPEC, popř. STEC atd. (b) z epidemiologických důvodů, někdy v kombinaci s důvody sub (a) – Salmonella, Shigella, Yersinia atd. a) Vyloučení EPEC U kmene identifikovaného jako Escherichia coli, proveďte antigenní analýzu pomocí sklíčkové aglutinace se dvěma polyvalentními séry. Pokud budou obě aglutinace negativní, lze konstatovat, že kmen nepatří mezi EPEC. b) Určení serovaru salmonely U kmene určeného jako salmonela proveďte antigenní analýzu sklíčkovou aglutinací a zjistěte, o který serovar se jedná. Předpokládejte, že u pacienta byl již dříve nalezen kmen serovaru Enteritidis a nyní je třeba jen ověřit, zda jde opět o tento kmen. Proveďte test s antisérem proti tělovým antigenům O: 9 a bičíkovému antigenu H: g, m. Úkol č. 6: Testy citlivosti enterobaktérií na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Enterobacteriaceae. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Kmen Antibiotikum (celý název) Zóna Æ (mm) Interpr. Zóna Æ (mm) Interpr. Zóna Æ (mm) Interpr. Úkol č. 7 Diagnostika kampylobakterů Prohlédněte si kolonie bakterie, která nevyrostla na KA ani Endově půdě a kterou podle morfologie považujete za pravděpodobného kampylobaktera, na speciální půdě. Zapamatujte si čtyři základní podmínky kultivace kampylobakterů: (a) speciální půda s aktivním uhlím a s přípravkem antibiotik a antimykotik k odclonění jiných mikrobů, (b) mikroaerofilní atmosféra, (c) zvýšená teplota na 42 °C, což odpovídá tělesné teplotě ptáků coby přirozených hostitelů, a (d) prodloužení kultivace na 48 hodin. Popište kolonie a zapište výsledek oxidázového testu, který demonstračně provede učitel. Pro kampylobaktery je typická opožděná pozitivita, tj. proužek zmodrá, ale až po chvíli, nikoli okamžitě.. Popis kolonií Výsledek oxidázového testu Další poznámky Úkol č. 8: Ureázový test v diagnostice helikobaktera V diagnostice helikobakterů se využívá mj. ureázový test, provedený přímo s bioptickým vzorkem žaludeční sliznice. Bioptát se položí na povrch půdy s ureou a indikátorem pH. V pozitivním případě půda začne poměrně rychle růžovět. Ze dvou vzorků (označených X a Y) vyberte, který je pozitivní. Výsledek: Pozitivní je kmen ____, negativní je kmen ____. Úkol č. 9 Diagnostika čeledi Vibrionaceae Vibrionaceae je bakteriální čeleď blízká Enterobacteriaceae, ale oxidáza-positivní. Pro jejich kultivace užíváme speciální půdy. Vzájemné rozlišení je možné pomocí biochemických testů jako u enterobakterií, dokonce i Enterotest 16 lze využít, pro vyhodnocení však musí být použita jiná matice. Antigenní analýza se rovněž využívá. Zakreslete, jak vibria vypadají mikroskopicky, a uveďte některé jejich vlastnosti podle prezentace, kterou vám promítá učitel. Mikroskopie: Nejdůležitější pevná půda pro kultivaci vibrií: Nejdůležitější tekutá půda pro kultivaci vibrií: Dva nejdůležitější serovary V. cholerae Dva nejdůležitější biovary V. cholerae O1 Kontrolní otázky: 1. Víte, jaký je u enterobakterií výsledek katalázového testu? 2. Z praktických důvodů tu chybí jedna půda, která se v diagnostice enterobakterií také používá – selenitový bujón. O jaký typ půdy jde a k čemu je dobrá? (Viz praktikum J03) 3. Znáte alespoň některé antigenní typy EPEC? 4. Čím by se lišilo provedení Úkolu 5b, kdyby u pacienta nebyl znám předchozí nález salmonely? 5. Který patogen především je diagnostikován Widalovou reakcí? O jaký typ reakce jde? Je přímá či ne? 6. Doporučují se antibiotika k léčbě gastrointestinálních infekcí? Proč? 7. Víte, co je ureázový dechový test a jaký je jeho princip? 8. Z kterého materiálu lze izolovat při tyfu Salmonella Typhi spíše než ze stolice?