Základy genomiky III. PnstHEflH^^^HBämi^Fnetiky MASARYK UNIVERSITY Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a prQ^|^^ Laboratoř molekulární fyziologie rostlin 18*%^ MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Základy genomiky III. ■ Zdrojová literatura ke kapitole III: ■ Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey ■ Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature, 431, 338-342. >M ff v| Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Přístupy „klasické"genetiky versus „reversně genetický" přístup ve funkční genomice Arabidopsis thaliana NÁHODNÁ MUTAGENEZE „Přímě genetický"přístup EMS 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně genetický" přístup T-DNA 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ AÉENOTYPEÉ^ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alely využití nestabilních inzerčních mutagenů revertantních linií izolac Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi ■ a ■ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů Typy inzerčních mutagenů • Mobilní elementy ■ autonomní transpozony (En-1) ■ obsahují gen pro transponázu, umožňující excizi a opětovné začlenění do genomu ■ na obou koncích obsahují krátké obrácené repetice, které jsou transponázou rozpoznávány Stabilní elementy ■ neautonomní transpozony (dSpm) ■ mutant En/Spm transpozonu, který mutací v genu pro transponázu ztratil autonomii ■ může být aktivován křížením s linií nesoucí En/Spm transpozon T-DNA zcela stabilní, její inzerce však může vést k chromozomovým přestavbám (inverze, delece, transpozice) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Vytváření knihoven inzerčních mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů ■ „trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR ■ hybridizace s produkty iPCR na filtrech Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR I.Knihovna En-1 inzerčních mutantů autonomní En/Spm, bez selekce 3000 nezávislých linií průměrně 5 kopií na linii trojrozměrné vyhledáváni pomocí PCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-7/linii) 28x3-tray pools pool 1......pool 28 ■ n 28 x 7 row pools 28 x 5 column pools 28 x 3 1 -tray pools 90 lil Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) □ identifikace pozitivní „trojice" pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Třírozměrné" vyhledávání v knihovně inzerčních mutantů pomocí PCR 1. Vyhledávání pozitivní trojice 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-7/linii) 28x3-tray pools Xho67 pool 1......pool 28 I En-8130 _k. Xho67 En-205 En-205 En-8130 1 (2x2x28=112 PCR reakcí) 1 262j 2% m ^H"5*^' 1 1 MACADVľ imi\ /rnciw 1 Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou CKI1 En-1 CKI1 CKI1 Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) □ identifikace pozitivní „trojice" pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou □ identifikace pozitivní linie pomocí Identifikace pozitivního „tácu", řady a sloupce Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Třírozměrné" vyhledávání v knihovně inzerčních mutantů pomocí PCR 1. Vyhledávání pozitivní trojice 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii) 28x3-tray pools Xho67 pool 1......pool 28 En-8130 _^ Xho67 En-205 En-205 En-8130 (2x2x28=112 PCR reakcí) 2. Identifikace linie nesoucí inzerci 3x1-1 I 333439363739»« 41 <2fl 4t««4T« 49SJE152fa54 5S5G fiř lil ffi Ceim mkcí MASARYK UNIVERSITY Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky CKI1 En-1 CKI1 1262 CKI1 CKI1 1262 Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů ■ „trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR ■ hybridizace s produkty iPCR na filtrech Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Hybridizace s produkty iPCR na filtrech Inzerční knihovna dSpm mutantů ■ The Sainsbury Laboratory (SLAT-lines), John Innes Centre, Norwich Research Park ■ DNA a semena v Nottingham Seed Stock Centre ■ 48.000 linií ■ průměrně 1.2 izerce na linii ■ neautonomní transposon ■ PCR vyhledávání nebo hybridizace s iPCR filtry ■ SINS (sequenced insertion sites) databáze http://nasc.nott.ac.uk Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Přístupy reverzní genetiky Identifikace sekvenčně specifických mutantů □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace □ inverzní PCR (iPCR) pomocí T-DNA specifických primerů □ příprava nylonových filtrů s produlty iPCR v přesně daném vzorci (poloze) pomocí robota □ hybridizace s genově specifickou sondou T-DNA Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Příprava FST knihoven z populace A. thaliana mutované pomocí T-DNA Sequencing of flanking sequence fragments Genomic DNA I a) digestion with endonuclease Bfal if b) linker ligation I linear "amplification" with primer annealing to T-DNA ^(mostly LB) I PCR amplification with a nested T-DNA primer ^ (and a linker primer) ^ sequencing with another nested T-DNA primer GABI-Kat (MPIZ, Koln) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů T-DNA start transkripce 1 1923 icactcgatttca cattAATTATTCACT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I gtgactaaagtgtaattaataagtga......... 13 Gl F G2 1Mb (+56) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací ■ kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alely využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolac revertantních linií ■ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Proč je nutné analyzovat příčinnou souvislost mezi inzercí a pozorovaným fenotypem ? ■ přítomnost více inzercí v jedné linii ■ možnost vzniku nezávislé bodové mutace ■ s inzercí T-DNA jsou často asociovány chromozomové aberace a přestavby (duplikace, inverze, delece) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. ■ Kosegregační analýza ■ kosegregace specifického fragmentu např. po inzerci T-DNA (nebo působení EMS atd.) do genomu s pozorovaným fenotypem + ++ + +++ ++ + Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií ■ transpozony se často vyznačují excizí a reinzercí do blízké oblasti-využití při izolaci nových mutantních alel ■ excize transpozonů není vždy zcela přesná-vznik bodových mutací - izolace revertantních linií s tichou mutací i stabilních mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Fenotyp šešulí cki1::En-1/CKI1 cki1::En-1/CKI1 CKI1/CKI1 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1 1. Izolace revertantních linií • PCR vyhledávání ve 246 rostlinách segregující populace • z 90 cki1::En-1 pozitivních 9 rostlin mělo kromě šešulí mutantních i šešule standardního typu Analýza potomstva • potvrzení absence inzerce pomocí PCR • PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerc • sekvenování Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1 2. Izolace stabilní mutantní linie analýza fenotypu segregující populace (CKI1/CKI1 CKI1/cki1::En-1) PCR analýza rostlin s mutantním fenotypem-identifikace rostlin bez inzerce PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce sekvencován Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií Základy genomiky lll, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací ■ identifikace nezávislé inzerční alely ■ využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi ■ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) ■ RNAi objevena u Coenorhabditis elegans ■ umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA (pravď. kontaminace obou při in vitro transkripci) ■ dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji ■ dsRNA indukce je závislá na vlastních genech-gen. vyhledávání RNAi ■ rnai Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference ■ Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) ■ RNAi objevena u Coenorhabditis elegans ■ je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u všech eukaryot ■ podstatou je tvorba dsRNA, která může být spuštěna několika způsoby: ■ přítomnost cizí „aberantní" DNA ■ specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cDNA ■ transkripce vlastních genů pro shRNA (short hairpin RNA) nebo miRNA(micro RNA, endogenní „vlásenková" RNA) ■ dsRNA je procesována enzymovým komplexem (DICER), což vede k tvorbě siRNA (short interference RNA), která se pak váže buď na enzymový komplex RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) nebo RISC (RNA-induced silencing komplex) ^^^^^H^ RISC zprostředkovává buď degradaci mRNA (v případě ISSiIIBIIkI úplné similarity siRNA a cílové mRNA) nebo vede pouze k NiBSíS^^iSbI zastavení translace (v případě neúplné homologie jako je Eln^wiwjKl RITS zprostředkovává reorganizaci genomové DNA (tvorba heterochromatinu a inhibice transkripce) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference Foreign DNA [nakedl Multigene family or repetitive transgene Foreign dsRNA Developmental or experimental transcription »imnmirm: hjhhehh mmmnnr jemD _nmnO Transgene CHĽ ^" * - r * r.r-Mw ;atiůn I T ch. assembly/ DNA/chnjít modification shRNA short hairpin RNA pre-miRNA micro RNA imranniia: senseRNA TTTTTTTTTTTTTTT Intermediate RNA-dependent RNA polymerase I I I I l I I t I I L I I I ďsRNA Diu« ii i i i i ...... mm SiRNA 11 i 111 111111 ...... ii 1111 i 11 n Target JJJJXL nun t RÍTŠ IM I I I M H 1 I ilKNA I M I I I ...... RľTS Heterochromatin formation and transcriptlona! silencing --®rÄrÄ \ risc/ \ i TGA niscy - fiisc mRNA destruction or transitional repression MASARYK UNIVERSITY Mello, 201 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" USA USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA University of Massic^jji|| Medical School Worcester, MA, USA b. 1959 b. 1960 : UNIVERSU Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Mechanizmus posttranskripčního umlčování genů pomocí RNA interference (iRNA) Highly transcribed single-copy transgene loci CHj CHj CHi ^- Viruses vims tin n s^e ne OR F vims Plo -^ tiaiisgene O Ft F — L /metí Inverted-repeat transgene loci -^ CHj CHj CHj CHj CHj CHj CHj CHj CHj trans sene ORF- - tijuisaene O Ft F antisense sense dsRNA uidA siRNA RISC-like (in FtN ,Vde gia dati o n coniple^ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky ■ 2. RNAi approach using regulated expression system Základy genomiky Ill, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III.-shrnutí Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ příprava sbírky mutantů ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR ■ vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alely využití nestabilních inzerčních mutagenů revertantních linií izolac Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi ■ a ■ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III.-diskuse Přístupy reverzní genetiky Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky