Základy genomiky MASARYK UNIVERSITY Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a pr^ei^^ Laboratoř molekulární fyziologie rostlin 18*%^ MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV. ■ Zdrojová literatura ke kapitole IV: ■ Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey ■ Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 ■ Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497-9501 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Analýza genové exprese ■ Metody kvalitativní analýzy genové exprese Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování ■ DNA a proteinové čipy ■ metabolické profilování ■ metody mikrodisekce Metody využívané ve funkční genomice rostli A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin Southern blot a DNA molekulární hybridizace izolace genomové DNA, PCR ■ ■ ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Nové trendy ■ chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese ■ Kvalitativní analýza exprese genů ■ Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese Transkripční fůze s promotorovou oblastí Identifikace a klonování promotorové oblasti genu příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza TATA box S' UTR ATG...ORF reportérového genu D Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese ■ Kvalitativní analýza exprese genů ■ Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) ■ Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika ľ analýza genové exf □ Translační fůze kódující oblasti analyzované repotérovým genem Identifikace a klonování promotorové aj& genu příprava rekombinantní DNA nesoucí pi GFP) ve fůzi s reportérovým genem příprava transgenních organismů nesoi jejich histologická analýza TATA bo)PprotPtŕďB|i8ff|Krórfiagh promotor • ~ počátek transkripce GAGGAGGCACAAAATGACGAA -//- TGTATTCTTTTGTTATCAAAGGGTTTCGACTTTGCTCCGAGGAAGAAGATAATAT Základy geMomiky IV., Metody fuMkčMí geMomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese ■ Kvalitativní analýza exprese genů ■ Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) ■ Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem ■ Využití dostupných publikovaných dat Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese g Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Analýza genové exprese ■ Metody kvalitativní a kvantitativní analýzy genové exprese ■ Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese na Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače následuje vyhledávání zajímavých fenotypů identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid- rescue ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. aktivační mutageneze ľ40S: Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Izolace genu CKI1 Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantní fenotyp je fenokopií exogenní aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT t-zeatin plasmid K2 35S::CK1 rescue cDNA no hormones 1) K1 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese na Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Systémy regulovatelné genové exprese ■ umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu ■ pOP systém Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Systémy regulovatelné genové exprese umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu pOP systém UAS systém http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese ■ Fenotypové profilování ■ DNA a proteinové čipy na Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Fenotypové profilování ■ DNA a proteinové čipy metoda umožňující rychlé porovMáMí velkého rrmožství geMŮ/proteiMŮ mezi testovaMým vzorkem a koMtrolou nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy , i ... - - Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array k dispozici komerčně aostupne sady pro cely crenom y , I ^ Critical Specifications ^.173 genu|g™™jj" g Q || Aiabidopsis It^^^mmm mám M^SSmmM WmW ■?-\11 gene araq usnesši Oligonucleotide probe langtti možnost PO«|Sh kSSSS II syntézy oligoB ŠjjjĚ ^^l|^MBJMTÄJIJ II touto technikcB BPffi^MPrPiB mám Detection aanaiti vity 'As measured by detection In comparative analysis between a complex target containing i control tranacrt pflons and a complex target wiHi no aplhes. ^čípyMeJeM pro aMalýzu exprese, ale Mapř. i geMotypováMí tSNFpolymorflzmy, sekveMováMí pomocí čipů, ...) ■ ■ ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ DNA čipy, analýza výsledků pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě) kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě - vlastní výsledek et kontrol i opakování Expression of 195M6T7 in response to chemical treatment / tf 3 f f Home I About TAI FJ | Sitemap | Contact | Help | Order | Login Search | Tools | Arabidupsis Inlu | NäwS | Unk» | FTP | StftC-kS J Gene Search | Experiment: Aluminum Stress Samples ^ Array ^ \. \ Design_\ View All \ v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. proteinové čipy ■ Proteinové čipy ■ čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů ■ analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami ■ možnost použít protilátky - stabilnější než samotné proteiny Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. proteinové čipy Identifikace proteinů interagujících integrinu aIIb(33 krevních destiček cytoplasmatickou částí exprese cytoplasmatické části jako fůzního peptidu biotin-KVGFFKR analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICln) další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2a, Krameret al., 2004) s ■ ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese ■ Fenotypové profilování ■ DNA a proteinové čipy ■ metabolické profilování ■ metody mikrodisekce ■ proteomické přístupy ■ Metody využívané ve funkční genomice rostlin ^^^^^v A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin ^^^^^w příprava transgenních rostlin ^^^^^^^^■^ PCR bhhí Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Arabidopsis thaliana huseníček polní, mouse-ear cress malé nároky na kultivační plochu velké množství semen (20.000/rostlinu a více) malý a kompaktní genom, (125 MBp, cca 25.000 genů, prům. velikost 3 kb) 5 chromozomů vhodná pro široké spektrum fyziologických experimentů velká přirozená variabilita (cca 750 ekotypů (Nottingham Arabidopsis Seed Stock Centre)) _ .Ä Columbia 0 Landsberg 0 Wassilewskija Q http://seeds.nottingham.ac.uk/ ■ ■ ■ ■ ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Arabidopsis, významný rostlinný model Počet záznamů v databázi „PubMed" (MEDLINE) vyhledaných pod heslem „Arabidopsis11 25.690/29.146 (16.10. 2008/22.10. 2009, meziroční nárůst 13%). (Pro srovnání, pod heslem „humaď nalezeno 10 620.405/ 11 151.170 záznamů), nárůst 5%. Entrez records Database name Protein Structure Genome Popset SNP 3D Domains GEO Datasets GEO Expressi ons UniGene UniSTS PubMed Centr al Gene Direct links 6i8,539 ii8,482 6i 6i,406 25,447 M64 "i\30,273 MASARYK UNIVERSITY i I o National Science Foundation, USA, , http://www.nsf.gov/bio/pubs/arabid/chap1.htm Taxonomy TAIR, http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace Arabidopsis prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens přenos bakteriální DNA do rostlinné buňky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace kokultivací listových disků Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace kokultivací kalusů Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace „nastřelováním" DNA Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Přant transformed ieedlmgs in sM. Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Nové trendy ■ chemická genetika ■ pojem chemická genetika - více než 50.000 záznamU v databázi PubMed (16.10. 2008) - - - ESU PubM5)ed r ^ iT tv iT . l f\. ťĎUdili Oftl» U.S ■ HllĽ™1 IJbmyof 1vTiJi:ťtv& íj^ tfc N-iti.^Itf Ťitnhť Mfa-iMi My NCBI U iďiiDiiiXiaai Search PubNfed " fa Uienical genets I tints I PnräuJIndex Hslory Clipboard j DeBib Duply I Sunmay f All 150407 J! Revieui:5562 fc] [Lrmr 1 ■ ZDcf Page |[T Q: LtA-hIJI, MnwamEB, GMmmlil I.iwt duár Eh. R6 6t d A rtfclei PitEiill bi L. Lkalo &. B*niil* T. Crxucxw)i.Z. m S^le Mdeorle StafeľtfS^orcpho* L^eled Available betone Fhotobleaching. CnnEhimBiftdkMl 200S Ott;9(J Jtll-20 . 11. Qtť6 M. EbtmY. aľZSZl NííL Recent ActNty Tin Off Cfeai Q amtauiujta.^nMT) mím Re B* d Articles, Lliki Q Fivecsesof^eta-m^pi^ii^edefi^iEydetededbyGC/MS PHID: lSBJ3t77 [PTiMlBi - * (t^plii lypaWutai] EP: ZhouM. PauZ TSxat-lvAiP, WiH. Re 6*dArticles, Lliks ill A conseived C-tenrrinal thirteen airrino acid motif of Gap 1 is required ' for the Gap 1 function and necessary forbiogenesis of a serine-rich glycoprotein of S treptococois parasangiiinis. In&ctliKimm. 2008 LĽtlj . [EpA ÍLmjI of print] Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. chemická genetika ■ Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky ■ v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky _ pomocí vyhledávání v „knihovně" chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transprtu do vakuoly ■ analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním médiu pomocí monoklonálních protilátek identifikované látky („sortiny") byly schopny vyvolat obdobné změny Arabidopsis_ (konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin) m oleklisMWpi^PÍPPÉ"^ pro bližší identifikaci molekWá^^""^^cesi ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů" byla provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCFjjttBHpriÉnipi^^ tuto sekreční (AmMIíIm pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů Zouhar et aI., 2004 změněnou citlivostí k sortinu senzitivní mutanti) (hyper- nebo hypo- Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky ■ u se 1 Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismu endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou identifikace proteinU zúčastňujících se regulace endomembránového transportu proteomické přístupy ■ vakuol identifikace a analýza proteomu ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Shrnutí ■ Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce ■ T-DNA aktivační mutageneze ■ ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese ■ Fenotypové profilování ■ DNA a proteinové čipy ■ metabolické profilování ■ metody mikrodisekce Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin PCR ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Shrnutí ■ Nové trendy ■ chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Diskuse Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky