Základy genomiky V. AnalýzMEOH^^^HHíVýHnterakcí MASARYK UNIVERSITY Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a prcfljPSmly Laboratoř molekulární fyziologie rostlin 18*%^ MASARYK UNIVERSITY Základy genomiky V., Protein-protein interakce Základy genomiky V. ■ Zdrojová literatura ke kapitole V: ■ Grefen et al., Molecular Plant, 1, 308-320 ■ Van Leene et al., Trends in Plant Science, 2008 ■ Walter et al., Plant Journal, 2004 ■ Wilt and Hake, Principles of Developmental Biology, Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. ■ Proč jsou proteinové interakce důležité ■ Funkční význam specifických interakcí proteinů ■ Metody analýzy proteinových interakcí in vivo ■ koimunoprecipitace ■ tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) ■ kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) ■ bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) ■ analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. Proč jsou proteinové interakce důležité ■ Funkční význam specifických interakcí proteinů Většina proteinů v buňce existuje ve formě komplexů, které mohou dále navzájem interagovat přenos signálu prostřednictvím G proteinu a fosfolipasy C signální kaskády využívající cAMP sestřih hnRNA interakce 5 snRNA a více než 50 proteinů regulace buněčného cyklu vývojově specifické procesy např. regulace buněčné diferenciace během embryonálního vývoje u Drosophily ■ ■ ■ ■ ■ Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. ■ Proč jsou proteinové interakce důležité ■ Funkční význam specifických interakcí proteinů ■ Metody analýzy proteinových interakcí in vivo ■ koimunoprecipitace ■ tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) ■ kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) ■ bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) ■ analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) Základy genomiky V., Protein-protein interakce založena na izolaci proteinových komplexů pomocí protilátek rozpoznávajících jeden z interagujících proteinů princip koimunoprecipitace využívá metoda pro potvrzení interakcí u proteinů, kde již tuto interakci předpokládáme pomocí tzv. pull-down assay Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. Metody analýzy proteinových interakcí in vivo calmodulin-binding protein (CBP) IgG vázající domény proteinu A (ProtA) místo rozpoznávané specifickou proteázou z TEV viru (tobacco etch virus) proteiny izolovaných komplexů jsou po rozdělení na 1D ELFO identifikovány pomocí MS výhodou je použití dvou nezávislých proteinových domén pro afinitiní purifikaci a tedy velká specificita Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. Metody analýzy proteinových interakcí in vivo ■ dvouhybridní kvasinkový test (Y2H) Hj izolace proteinových komplexů pomocí rekombinantních proteinů, každý z nich fúzovaný s částí transkripčního faktoru Gal4 jeden z proteinů (návnada, bait) fúzovaný s DNA vazebnou doménou Gal4 (Gal4-BD) druhý z proteinů (kořist, prey) fúzovaný s aktivační doménou Gal4 (Gal4-AD) Interakce proteinů umožní rekonstituci vazebné domény s aktivační doménou a spuštění reportérového genu vizuální detekce (modré zbarvení, LacZ) auxotrofní selekce (růst na médiu bez histidinu, His) umožňuje vyhledávání interakčních partnerů expresních knihovnách jednotlivých organismů ■ ■ ■ ■ v Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. Metody analýzy proteinových interakcí in vivo ■ bimolekulární fluorescenční komplementace [ Proteinová interakce je detekována na základě reasociace fluoreskujícího proteinu každý z potenciálních interakčních partnerů je fúzován s jednou z podjednotek fluoreskujícího proteinu, např. YFP při interakci dojde ke znovuobnovení fluorescence Kromě identifikace vlastní interakce umožňuje i lokalizovat interakci v buňce I / ťapV'ighr © 2006 Natur« Pübl^hi-ng Liroup Njiure Reviews | MoltiuLir Cel1. Bio Logy Základy genomiky V., Protein-protein interakce membránový protein je fúzován s fluoreskujícím proteinem potenciální ineterakční partner je fúzován s jimým fluoreskujícím proteinem, lišícím se svým emisním spektrem v případě interakce dojde ke změně lokalizace cytoplazmatického proteinu na membránu (kolokalizaci s membránovým proteinem) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V.-shrnutí ■ Proč jsou proteinové interakce důležité ■ Funkční význam specifických interakcí proteinů ■ Metody analýzy proteinových interakcí in vivo ■ koimunoprecipitace ■ tandemová afinitní purifikace (TAP-tag) ■ kvasinkový dvouhybridní test (Y2H) ■ bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) ■ analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA) Základy genomiky V., Protein-protein interakce Genomika V. Diskuse Základy genomiky V., Protein-protein interakce