Studium vazby molekul za použití anizotropie fluorescence
Změna anizotropie fluorescence je používána při popisu vzájemné interakce molekul.
V případě, že se fragment DNA s fluorescenční značkou volně pohybuje (rotuje) v roztoku, je
pozorovaná anizotropie relativně nízká. V případě, že dojde ke vzniku komplexu DNA a
proteinu, dochází k výraznému snížení pohyblivosti DNA s fluorescenční značkou, což má za
následek zvýšení anizotropie fluorescence.
Při titrování roztoku fluorescenčně značené DNA roztokem DNA-vazebného proteinu dochází
k postupné vazbě molekul proteinu na vazebná místa jednotlivých molekul DNA a tedy
k postupnému zvyšování anizotropie fluorescence. Protein se na vazebná místa na DNA váže
až do okamžiku, kdy je koncentrace proteinu tak vysoká, že jsou všechny molekuly DNA
obsazeny. V tomto momentě anizotropie fluorescence dosáhne maximální hodnoty a přestane
se dále zvyšovat. Koncetrace proteinu, při které hodnota anizotropie fluorescence tvoří 50 %
maximální hodnoty, se nazývá disociační konstanta (Kd). Ta reprezentuje afinitu (sílu
vazby) konkrétního proteinu k DNA. Studium změn Kd v závislosti např. na iontové síle či
teplotě umožňuje získat cenné poznatky o povaze komplexu protein-DNA a o mechanismu,
jakým spolu obě makromolekuly interagují.
Materiál
* 30 pmol vysušeného fragmentu DNA (GTTAGG)4 značeného Rhodaminem Red X
(ex = 572, em = 591 nm)
* Roztoky proteinu (lidský telomer-vazebný protein TRF1, MW = 110 kDa) o
koncentracích 1M a 20M
* Pufr P (20mM HEPES, 180mM KCl, 0,1mM EDTA, 3mM MgCl2, pH 8.0)
* 1M DTT
* Spektrofluorometr vybavený polarizátory pro měření anizotropie fluorescence
* Mikrokyveta s magnetickým míchadlem
Postup
1) Resuspendovat vysušenou DNA v 1,5 ml pufru P a důkladně vortexovat. Výsledná
koncentrace DNA bude 20nM.
2) Pufrem P naředit resuspendovanou DNA na 2nM, resp. 10nM roztok o objemu 1,5 ml.
Přidat 1.5 l 1M DTT. Roztok přenést do kyvety. Kyvetu při manipulaci odzátkovávat jen
na nezbytně dlouhou dobu, aby bylo zamezeno vnášení částic prachu do vzorku.
3) Na fluorimetru 5x změřit anizotropii fluorescence pomocí funkce ,,batch experiment" a
nastavení uloženém v souboru ./RedX_titrator/p0.xml (ex = 572 nm, em = 591 nm, šířka
štěrbin 8/8 nm). Hodnoty anizotropie zaznamenat do tabulky v software SigmaPlot.
4) Postupně přidávat 1M roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného roztoku byl 3, 5,
10, 20 a 50 l. Po každém přídavku 5x změřit hodnotu anizotropie fluorescence a
zaznamenat do tabulky v software SigmaPlot.
5) Postupně přidávat 20 M roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného roztoku byl 3,
5, 10 a 20 l. Po každém přídavku 5x změřit hodnotu anizotropie fluorescence a
zaznamenat v software SigmaPlot.
6) V software SigmaPlot provést úpravu hodnot anizotropie na změnu objemu po přídavku
roztoků proteinu.
7) Pomocí software SigmaPlot vynést do grafu závislost korigovaných hodnot anizotropie
fluorescence na koncentraci přidaného proteinu.
8) Pomocí software SigmaPlot analyzovat křivku vazby proteinu a stanovit disociační
konstantu Kd.
Obr. 1. Závislost anizotropie fluorescence značeného fragmentu DNA na koncentraci proteinu.
Kd = 17  1 nM