Fluorescenční určení koncentrace proteinu
Určení koncentrace proteinu je nezbytným krokem při analýze biologického materiálu a je
součástí mnoha laboratorních protokolů. Citlivost nejčastěji používané Bradfordové metody,
která se prakticky pohybuje od 0.1 do 1 mg/mL, je mnohdy nedostatečná. Pro určení
koncentrace roztoku proteinu lze s výhodou použít fluorescenční sondu NanoOrange.
Pomocí NanoOrange lze bezpečně určit koncentraci roztoku proteinu v rozsahu 0.1 ­ 10
g/mL.
Fluorescenční sonda NanoOrange vykazuje nízkou intenzitu fluorescence ve vodném
roztoku. Po její vazbě na molekulu proteinu dochází k výraznému zvýšení intenzity
fluorescence. NanoOrange má excitační maximum kolem 470 nm a emituje v oblasti 550 nm.
Materiál
* 500X Roztok NanoOrange v DMSO
(NanoOrange Protein Quantitation reagent,
Molecular Probes, Invitrogen)
* 10X reakční pufr (diluent)
* Roztok BSA - hovězí sérový albumin (2 mg/mL)
* Spektrofluorometr
* Mirokyveta (1.5 mL)
* Termoblok pro zahřátí na 95°C
Příprava roztoků
Upozornění
Zásobní roztok NanoOrange obsahuje DMSO a musí s ním být nakládáno opatrně, protože
DMSO usnadňuje průnik organických molekul do tkání.
1X NanoOrange roztok
Naředit 1.5 ml 10x reakčního pufru do 13.5 mL vody. Přidejte 30 L 500X zásobního
roztoku NanoOrange. Chránit před světlem. Použitelnost roztoku je několik hodin.
Standardní roztok BSA
Připravit 10g/mL roztok BSA (objem 2mL) v 1X NanoOrange roztoku.
Ve 2 mL mikrozkumavce 200X naředit zásobní roztok BSA (2mg/mL) v NanoOrange
roztoku a promíchat.
Vytvoření standardní křivky
Naředit standardní roztok BSA 1X NanoOrange roztokem na koncentrace od 6 do 0.1 g/mL
do mikrozkumavek podle tabulky.
Výsledná koncentrace BSA
(g/mL)
Objem 10 g/mL standardního
roztoku BSA (L)
Objem 1X roztoku
NanoOrange (L)
6.0 900 600
3.0 450 1050
1.0 150 1350
0.6 90 1410
0.3 45 1455
0.1 15 1485
Příprava neznámého vzorku
1. Nařeďte 30 L neznámého vzorku v 1470 L 1X NanoOrange roztoku (50X zředěno)
ve 2mL mikrozkumavce.
2. Nařeďte 15 L neznámého vzorku v 1485 L 1X NanoOrange roztoku (100X
zředěno) ve 2mL mikrozkumavce.
Poznámka: Objem neznámého přidávaného vzorku by neměl přesáhnout 4% celkového
objemu, aby nedocházelo k ovlivnění intenzity fluorescence NanoOrange složkami pufru.
Denaturace
1. Inkubovat standardy BSA i neznámé vzorky na 95°C po dobu 10 minut v termobloku
ve tmě.
2. Nechat vychladnout na pokojovou teplotu v plastovém stojánku ve tmě.
3. Po vychladnutí promíchat a stočit v centrifuze, aby se na víčku kondenzovaná voda
vrátila zpět do roztoku.
Měření fluorescence
1. Zapněte spektrofluorometr podle návodu.
2. Změřte intenzitu fluorescence
* v módu Single point při ex= 470 nm a em= 550 nm, šířka štěrbin (slits)
2nm/2nm, integrační čas 5 s (Fluoromax)
* v módu Read při ex= 470 nm a em= 550 nm, šířka štěrbin (slits)
10nm/10nm, integrační čas 5 s (LS50)
* současně kromě módu Read lze měřit na spektrofluorometru LS50 v módu
Concentration, který umožňuje přímé vyhodnocení a určení koncentrace
neznámého vzorku
3. Změřte nejdříve intenzitu fluorescence blanku, následně standardy.
4. Hodnoty intenzity zapište do tabulky a vyneste do grafu hodnoty intenzity
fluorescence standardů po odečtení hodnoty blanku.
5. Změřte intenzitu fluorescence pro obě ředění neznámého vzorku.
6. Po odečtení intenzity blanku určete podle standardní křivky koncentraci DNA
v neznámém vzorku.
Výsledky
Stanovení koncentrace proteinu neznámého vzorku.