Vlastní fluorescence proteinů
Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami v nich
obsaženými: tryptofanem (Trp), tyrozinem (Tyr) a fenylalaninem (Phe). Dominující je
fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin. V této úloze jsou
změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého tryptofanu, tyrozinu a
fenylalaninu.
Vlastnosti L-tryptofanu
* MW = 204,23
* absorpční maximum: exmax = 295 nm
* fluorescenční emisní maximum: emmax = 353 nm
* emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí
Vlastnosti L-tyrozinu
* MW = 181,19
* absorpční maximum: exmax = 275 nm
* fluorescenční emisní maximum: emmax = 304 nm
* emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla
Vlastnosti L-fenylalaninu
* MW = 165,19
* absorpční maximum: exmax = 260 nm
* fluorescenční emisní maximum: emmax = 282 nm
* emise Phe je strukturovaná
Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových délkách,
takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový výtěžek
fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci v proteinech lze
selektivně excitovat při 295-305 nm.
Materiál
* L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem), L-fenylalanin (Applichem)
* Hovězí sérový albumin (MW = 69000)
* pufr A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7,4)
* skleněné zkumavky, mikropipety, ...
Postup
1. Připravte zásobní roztoky 10 mM Trp, 2 mM Tyr, 10 mM Phe a 0,25 mmol/l albuminu
v pufru A.
2. Pro vlastní měření je nařeďte pufrem A na koncentrace 5  Trp, 20 M Tyr,
200 M Phe a 0.6 M albuminu.
3. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce.
excitační spektrum emisní spektrum
em (nm) ex (nm) ex (nm) em (nm)
L-tryptofan 350 240-320 280 300-420
L-tyrozin 300 240-290 270 280-360
L-fenylalanin 280 240-270 250 260-360
albumin 350 240-320 280 300-420
Výsledky
Změřená excitační a emisní spektra vlastní fluorescence tryptofanu (Trp), tyrozinu (Tyr),
fenylalaninu (Phe) a albuminu v pufru A jsou na Obr.1 a Obr 2. Z výsledných spekter je
zřejmé, že prakticky veškerá vlastní fluorescence albuminu pochází od tryptofanu. Měření
byla provedena na spektrofluorometru FluoroMax-4.
Obr. 1 Excitační spektra 5 M Trp (em = 350 nm), 20 M Tyr (em = 300 nm),
200M Phe (em = 280 nm) a 0.6 M albuminu (em = 350 nm).
250 300 350 400
0.0
2.0x10
5
4.0x10
5
6.0x10
5
8.0x10
5
1.0x10
6
1.2x10
6
ALB
Intenzitafluorescence
 (nm)
PHE
TYR
TRP
Obr. 2 Emisní spektra 5 M Trp (ex = 280 nm), 20 M Tyr (ex = 270 nm),
200 M Phe (ex = 250 nm) a 0.6 M albuminu (ex = 280 nm).
240 260 280 300 320
0.0
2.0x10
5
4.0x10
5
6.0x10
5
8.0x10
5
1.0x10
6
1.2x10
6
Intenzitafluorescence
 (nm)
TRP
PHE
TYR
ALB