„Neesenciální struktury“ • Inkluze • Vrstvy vně buněčné stěny • Struktury pohybu • Fimbrie Inkluze • Zásobní látky • produkty metabolismu • uložené nepotřebné látky z vnějšku a prozatím bez funkce (kvasinky a stafylokoky hromadí vitamíny) • Bez membrány nebo s membránou ------ není biologická ----- není dvojvrstvou fosfolipidů. Je jednovrstevná: bílkovina+lipid bílkovina+polysacharid • Svým charakteristickým vzhledem uvnitř buněk napomáhají identifikaci – zde si všímáme barvitelnosti těchto struktur či jejich pozorování bez barvení · V cytoplazmě v podobě granul nebo kapének hl. starších buněk! · Při produkci rekombinantních proteinů poskytují inkluze možnost „zabalení“ a stabilizace těchto proteinů (ochrana před proteázami), dál možnost jejich nahromadění (jsou v jednom klubíčku - usnadnění následné purifikace a navíc jsou izolovány od rozpustných proteinů cytoplazmy) • Rozvoj využití inkluzí (s obsahem enzymů) v suspenzi jako katalyzátorů v průmyslu a biotechnologiích – použití „surových inkluzí“ bez refoldingu proteinů, tedy v jejich nerozpustné formě. • Aktivita enzymů je v nich vysoká! • Inkluze jsou snadno odstranitelné po skončení reakce – centrifugací. • Výhoda: vysoký obsah proteinů; možnost agregace i rekombinantních proteinů (enzymů) bez jejich inaktivace. a) obdané membránou – 1 vrstva fosfolipidů (až na plyn.vakuoly) • Glykogen • PHB • Síra • Plynové vakuoly • Karboxizómy • Chlorobiové váčky Glykogen • membránový 160 – 300 nm, až 50% sušiny • počet 1-10 • rozpustný polymer glukózy • α-1,4 vazby a α-1,6 větvení na každém 8-10tém monomeru • Může a nemusí mít membránu • Ve světelném mikroskopu není viditelný: Barvení Lugolovým roztokem Bakteriální glykogen je silně větvený. Slouží jako pohotová rezerva. PHB • kyselina polyhydroxymáselná • až 60% sušiny • viditelná ve světelném mikroskopu • Je to odpadní produkt metabolismu uhlíkatých látek • Vyskytuje se u aerobů: Bacillus, Pseudomonas Poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) in a Rhodospirillum species. PHB is one type of PHA. PHB a glykogen jsou osmoticky a iontově neaktivní, vyskytují se v buňce při nadbytku zdrojů uhlíku a nedostatku zdrojů dusíku. Síra • viditelné kapénky amorfní síry se vyskytují ve skupině chemolitotrofních sirných bakterií schopných oxidace redukovaných sirných sloučenin (sirovodíku, thiosulfátu), je tedy pro ně zdrojem energie. • Dále se vyskytuje u fototrofních sirných bakterií – zelených a purpurových. Pro ně již není zdrojem energie (tyto přijímají energii transformací slunečního záření), ale zdrojem elektronů v procesu fotosyntézy. Oxidace sirovodíku primárně poskytuje elementární síru. Když je sirovodík vyčerpán, síra je následně oxidována na sulfát. Plynové vakuoly cylindrické aerosomy (45 – 200 nm) nadlehčující sinice a planktonní bakterie (cca u 50ti rodů bakterií; purpurové a zelené sirné a halofilní Archea) plyny vznikajícími při metabolismu – podle jeho intenzity buňka množství plynu reguluje, čímž reguluje i svůj vertikální pohyb. • U archeí například napomáhají pohybu ve vodě s extrémní salinitou. • Množství plynu závisí na teplotě a viskozitě. • Membrána je z jedné vrstvy bílkovin, nepropustná pro vodu. Tato rigindní struktura však může při kritickém tlaku prasknout. • Šířka vakuolky je geneticky determinovaná (v r.1994 známo 14 genů) Karboxizómy • protáhlé polyhedrické cisterny • usnadňujíci fixaci CO[2],enzymy Calvinova cyklu • syntéza hexóz u autotrofů, chemolitotrofů a fotolitotrofů. • za vhodných podmínek je vyšší počet (1-10) • nedělí se Chlorobiové váčky • Jen zásobárny pigmentů – bakteriochlorofyl a karotenoidy • Nikoli reakce a vazba světla • Přenášeny do chromatoforů, kde vlastní fotosyntéza • Počet: 2-10 Magnetosomy • krystaly oxidu železnato – železitého (Fe[3]O[4]) vytvářející permanentní magnetický dipól a dovolující orientaci v magnetickém poli = magnetotaxe. • většina bakterií s magnetosomy jsou vodní organismy citlivé ke kyslíku; tyto částice jim napomáhají klesání v gradientu O[2] ve vodním sloupci. • obaleny speciální membránou umožňující precipitaci Fe[3]O[4] b) bez membrány Glykogenová granula – 20 – 100 nm, jedna buňka je může mít pouze s nebo bez membrány, v rámci rodu lze obojí zároveň. Krystaly – produkty metabolismu (oxalacetát) Parasporální inkluze = bílkovina vznikající při sporulaci. Je to zbytkový materiál nespotřebovaný při vzniku spor. Bioinsekticidy – Bacillus thuringiensis – na moučné červy, i selektivní působení (až na druhy) Polyfosfátová granula = volutin - při nadbytku ATP (možnost uložení velkého množství P při nadbytku energie). • Akumulace se děje z toho důvodu, že v prostředí je častý nedostatek fosfátu (limitující živina). • Je dobře viditelný pod mikroskopem. • Až 500 molekul, nerozpustný ve vodě. • Nikdy není zdrojem energie, jen fosforu. • Počet: 1 – mnoho, podle metabolismu. • Vysoký počet je v době před přechodem do klidového stadia (známka sporulace). • Slouží jako: rezervoár fosforu, alternativní zdroj P (namísto ATP) při fosforylaci cukrů při jejich katabolismu, chelatační činidlo divalentních iontů, jako pufr při alkalickém stresu a jako regulátor při odpovědích na stres • Transport fosfátu do buňky se děje hlavně těmito dvěma mechanismy: • nespecifický transport s nízkou afinitou (konstitutivně exprimovaný transportér) • specifický přenašeč s vysokou afinitou pro fosfát: prim. transport H2PO4- a HPO4 2-. Komplex polyP vzniká za silné energetické dotace při nadbytku ATP (možnost uložení přebytku energie ve formě P). Vazba vyžaduje ATP Pigmenty • Produkty primárního i sekundár. metabolismu. Produkovány v závislosti na stanovišti. • Využívají se při metabolismu nebo mají protektivní účinek či jiný ekologický význam (inhibiční účinky). Pokud jsou produktem primárního metabolismu – jsou bezpodmínečné potřeby (bakteriochlorofyl, karotenoidy). • Protektivní účinek – absorbuje světlo o určité vlnové délce, jsou syntetizovány až v rámci sekundárního metabolismu. Př: absorbce UV záření, pufry při ničení kyslíkatých radikálů – to je důležité např. u patogenů: fagocyty na ně nemohou toliko působit např. peroxidem vodíku! Př: karotenoidy Streptococcus B – závažný původce pneumonií a meningitid u novorozenců; zlatý karotenoid Staphylococcus aureus opět brání proti oxidačním reakcím imunitního systému) či má jiný ekologický význam (inhibiční antibiotické účinky exopigmentů). • Buňka může produkovat endo- (protektivní) i exopigmenty různých barev. • Řada pigmentů vzniká nadprodukcí látek. Př: kolonie Azotobactera na manitolové půdě po týdnu zčernají (zprostředka) – na základě nadprodukce tryptofanu • Lokalizace (podle své úlohy): v cytoplazmě, v CM u fototrofů, v periplazmatickém prostoru, (v buněčné stěně u kvasinek), jako exopigmenty – ekologický význam (inhibiční agens, ATB). Nejčastěji: karotenoidy – endopigmenty u většiny buněk • Bakteriochlorofyly a,b,c,d – anaerobní prostředí • Prodigiozin – extracelulární, mikrobicidní účinek – bakterie a plísně • Fenaziny– extracelulární, sek. metab., mikrobicidní účinek – bakterie a plísně (Erwinia) • Melaniny – hnědé, černé, tmavě červené. V závislosti na době kultivace. • Anthokyany – sek.metab., barva závisí na pH, u 5 druhů bakterií • Př: Micrococcus flavocianus – žlutý endopigment a fialový exopigment. Na MPA jen žlutý endop. Na glukozókvasničním agaru – oba pigmenty. Struktury vně buňky • Kapsuly – mikro a makro - dobře organizované, rigidní, AMK nebo cukry Bacillus – kyselina glutamová Bacillus anthracis – poly-D-glutamová • Slizy - polysacharidy - lépe odstranitelné, difúzní, neorganizované • S – vrstvy - pravidelně organizované proteiny a GP Glykokalyx = kapsuly a slizy Struktury vně buněčné stěny • ochrana před fagocytózou • před protilátkami • před vysycháním • před detergenty • vazba na povrch předmětů, tvorba biofilmu Pouzdro = kapsula • u téměř všech zástupců Enterobacteriaceae • zřetelně odděluje buňku • má antigenní vlastnosti, znemožňuje detekovat somatický antigen. Charakteristické pro virulentní kmeny. Míra virulence: formy S, M a R • působí proti fágům, protilátkám a fagocytóze, jako ochranná vrstva proti vlivům prostředí a proti první vlně imunitní odpovědi • je to vrstva dobře organizovaného materiálu, který nelze snadno odmýt z buněčného povrchu Kapsula - virulence Mikrokapsula – do 0,2 nm • syntetizována stále • překrývá antigen buněčné stěny a má své vlastní antigenní vlastnosti • Složena z bílkovin, lipidů a polysacharidů • Není to bariéra proti průniku živin • Průkaz – ne mikroskopicky, pouze serologicky • Důkaz u vitální buňky: barvením tuku, terčíky v mikrokapsule, ale barveny i tukové kapénky v buňce. Makrokapsula • složena z polysacharidů, bílkovin nebo celulózy • minimálně dvakrát tlustší než buňka • velikost není geneticky kódována • Průkaz prostý: téměř jednotné složení – převažuje buď pouze bílkovina nebo pouze polysacharid. Lipidy jen do 1%. • Streptococcus – polysacharid • Bacillus anthracis – bílkovinná složka kyseliny poly-D-glutamové • Bacillus – k. glutamová • S-vrstva - jeden druh bílkoviny - druhově specifické - monovrstva - pravidelně organizovaná vrstva proteinů a glykoproteinů na povrchu bakt. buňky • Sliz – řídký difúzní neorganizovaný materiál - spojuje více buněk, snadno odstranitelný, nejčastěji polysacharid - může sloužit k pohybu ve vlhkém prostředí. Glykokalyx • netvoří se v laboratorních podmínkách za dostatku živin = síťovina z vláken polysacharidů a glykoproteinů • umožňuje adherenci, která je málo (za pomoci kationtů, Př: zub) až vysoce (za pomoci lektinů, Př: uretra) specifická • Kationty umožňují spojení stejně nabitých buněk a povrchů, elektrostatické síly Pochvy Pouze mechanická funkce. • geneticky kódované • výhradně z polysacharidů • chemické složení a zbarvení druhově specifické • glukóza + kyselina glukuronová (Sphaerotilus) u jiných rodů např. fukóza • Někdy obsaženy hydroxidy kovů – v malém množství (zbarvení; Fe, Mn, Cu; závisí na druhu) • Př: Sphaerotilus, Leptothrix Sphaerotilus natans Bakteriální cytoskelet • řada vláknitých proteinů nutných pro regulaci tvarování buňky, polaritu buňky, buněčné dělení a segregaci chromozomů a plazmidů • jsou analogické třem cytoskeletárním strukturám eukaryotní buňky (3D strukturou, biochemickými vlastnostmi) • nedávné technologické pokroky osvětlily vazby mezi buněčným dělením a segregací chromozomů Původ bakteriálního aktinového cytoskeletu • v bakteriálních buňkách funguje analog tubulinu, jmenovitě FtsZ (filamentous-temperature sensitive protein Z) • u druhu (a u více rodů) Bacillus subtilis objeven analog aktinu - protein MreB , bez tohoto genu ztrácí svůj tvar • je složen z páru polymerů; zbývá pochopit, zda MreB formuje vlákna • distribuce MreB genů v říši Bacteria ukazují, že nesférické buňky vlastní jeden nebo více těchto genů • zkoumána podobnost krystalická struktura proteinu MreB (T. maritima) vs. aktin - pomocí MAD (multiple anomalous dispersion), RTG, EM - strukturálně jsou si podobné, i svou orientací - krystaly MreB formují 2 shod. podjednotky jako u aktinu • markantní rozdíl mezi polymery MreB a F-aktinem: - eukaryotní aktin tvořen 2 protofilamenty jemně propletenými do helikálního vlákna - bakteriální „aktin“ sestává z páru rovných protofilament • další podrobně studované proteiny s vlastnostmi aktinu jsou ParM (E. coli) a MamK (Magnetospirillum magneticum) a crescentin – podobnost intermediánním filamentům (Caulobacter crescentus). Caulobacter crescentus • strukturální analog aktinu (MreB) - předurčení tvaru buněk C. crescentus, Escherichia coli, Bacillus subtilis • koordinuje buněčnou morfogenezi ve spojení s MreC proteinem obalujícím buňku uvnitř periplazmatického prostoru • v buňkách Caulobacter crescentus, je protein MreC spojen s penicilin vázajícím proteiny (PBPs), které katalyzují inzerci intracelulárně syntetizovaných prekurzorů do buněčné stěny • MreC je podstatný pro prostorovou organizaci složek holoenzymů periplazmy syntetizujících peptidoglykan • MreB řídí řídí lokalizaci prekurzorů peptidoglykanu v cytosolu • Fluorescenční značení Van dokazuje, že MreB a FtsZ, MreC a RodA působí při syntéze PG. • MreB a FtsZ jsou vyžadovány pro morfogenezi polární stélky. • FtsZ (filamentous-temperature sensitive protein Z) = protein buněčného dělení • je vyžadován pro start časné syntézy peptidoglykanu vedoucí k tvorbě mezivrstev, reguluje tedy prodlužování buňky zatímco MreB je nutný pro prodlužování stélky. • Bakteriální cytoskelet a proteiny určující tvar buněčné stěny jako MreC spolupracují při lokalizaci komplexů koordinovaně syntetizujících buněčnou stěnu • FtsZ reguluje prostorové umístění enzymu MurG produkujícího lipid II (prekurzor peptidoglykanu). Časné umístění FtsZ do kruhové struktury během prodlužování buňky je následováno převedením MurG a přesměrování syntézy prekurzorů peptidoglykanu do středu buňky. Děje se tak před buněčnou konstrikcí s přispěním k elongaci buňky. • Za nepřítomnosti FtsZ se enzym MurG neakumuluje uprostřed buňky a buněčná elongace pokračuje inzercí peptidoglykanu i po okrajích buněčné stěny. Buňka tedy k elongaci využívá systém syntézy buněčné stěny závislý i neávislý na FtsZ; důležitost jednoho nebo druhého režimu závisí na načasování uspořádání FtsZ během elongace buňky. Vláknité útvary na povrchu buňky • bičík • fimbrie, pili • curli Pohyb bakteriální buňky • swimming motility – pohyb bičíky, plavání • swarming motility – plazivý pohyb kolonií, bičíky, Proteus • twitching motility – trhavý, skákavý pohyb • gliding motility – klouzavý pohyb Důvody pohybu bakterií • nejčastější – pohyb ke zdroji živin – po koncentračním gradientu • reakce na repelent • Intenzita odpovědi závisí na počtu bičíků, na teplotě a viskozitě prostředí. • shlukování buněk za účelem vytvoření plodnice - Myxobacteria Vnitřní faktory ovlivňující pohyb • počet bičíků • lokalizace bičíků na buněčném povrchu (nejpomaleji reagují peritrichia, efekt rychlý u vibrií, v = několik mikrometrů za sekundu) • dostatek redukčních ekvivalentů Bakteriální bičík • semirigidní vláknitá struktura tvořená 1 – 4 proteiny – globulární flagelin • podobná stavba u všech dosud zkoumaných druhů bakterií • tloušťka 13 – 20 nm • rychlost pohybu – 1 – 100 mm/s • atraktant – fyzikální nebo chemický faktor • supramolekulární komplex, několik řetězců bílkovin - tvoří jej více jak 4 vlákna oproti fimbriím • molekul.hmotnost flagelinu větší než pilinu • flagelární antigen, tvořen specif. bílkovinami, nemůže být zakryt kapsulárním ani somatickým antigenem • začíná v CM (oproti fimbriím, kt. jsou strukturou B.S.) • délka bičíku několikanásobně větší než délka buňky • bičíky lze snadno odstranit sklem (pipeta, tyčinka) • G+ : zakotvení do CM a B.S.: bazální tělísko, 2 disky – jeden v CM, druhý v periplazmat. prostoru, B.S. kluzné ložisko-tam se otáčí osa, háček pro ohyb • G- : B.S. ne tak pevná, navíc vnější membrána • L a P pruh horního kruhu – vnější membrána a PG (buněčná stěna – P pruh) Komponenty bičíku: • vždy bazální tělísko – u G- 4kruhy (CM, PG a VM) G+ - 2 kruhy v CM • háček (hook) • vlastní vlákno (jen to antigenem) • Bazální tělísko zůstává po odstranění bičíkového vlákna, to je do 20 až 30 min dosyntetizováno Ultrastruktura bičíku uspořádání: taxonomický znak 1) polárně – 1 nebo oba póly - monotricha (Pseudomonas): pohyb dopředu: proti směru hodinových ručiček. Otáčení buňky: po směru hodinových ručiček. - amfitricha (Spirillum) - lofotricha (Spirillum) 2) po celém povrchu – peritricha (Proteus vulgaris, Agrobacterium). • Pohyb dopředu: shloučení bičíků a pohyb proti směru hodinových ručiček. • Díky náboji se nezamotají. • Rozpletení = kroucení buňky na místě. • „Chce-li“ se buňka pohybovat jedním směrem, namotá bičíky, které jsou ve směru pohybu, na sebe a je tlačena bičíky druhé strany Pohyb Prokaryota vs eukaryota • rotace bičíku kolem vlastní osy – pouze u prokaryot a vždy 1 směrem • motor – jeho rotační pohyb způsobuje pohyb celého bičíku • poháněn proton motive force (pmf) – pohyb protonů přes cytoplazmatickou membránu • výjimka – alkalifilni bacily – pohyb iontů Na = „Na motive force“ • vnější faktory ovlivňující pohyb: magnetické pole Země (zvl.struktury – magnetosomy (Aquaspirillum) od dvou do několika desítek, uvnitř či ve středu buňky, málo v blízkosti jádra) chemotaxe (odpověď na změny ve vnějším prostředí, funguje i při ↑ c živin, negativní chemotaxe od barviva, rychlost pohybu úměrná koncentraci barviva) fototaxe (odpovědí na světlo je pohyb ↑ rychlosti než při chemotaxi) aerotaxe Plazivý pohyb kolonií (swarming) • Proteus, Vibrio • pohyb indukovaný kontaktem s tuhým médiem • delší buňky, více bičíků • oblak, roj buněk, který se pohybuje koordinovaným pohybem • má schopnost přerůstat i vyvýšené útvary na médiu Klouzavý pohyb (Gliding motility) • na pevných površích • mechanismus nejasný • pmf patrně zahrnuty • přizpůsobení – slizy, surfaktanty, struktury podobné motoru v BS, specif. membránové komponenty, které tvoří reverzibilní vazbu se substrátem, actine-like systém Gliding motility • Makoto Miyata, profesor Osaka City University zkoumal klouzavý pohyb Mycoplasma mobile. Za pomoci cytoskeletárních filament udržují nesférický tvar. („They look like schmoos that are pulled along by their heads. How they are able to glide is a mystery“.) • Miyata, M., Ryu, W.S., and Berg, H.C. "Force and velocity of Mycoplasma mobile gliding." J. Bacteriol. 184, 1827-1831 (2002). motility test medium, polotekuté Pohyblivý kmen roste i mimo inokulaci – v celém mediu Pozorování pohybu bičíku – visutá kapka - důležitý dostatek kyslíku v temném poli a intenzivním světle Pozorování bičíků samotných – světelný mikroskop po spec. barvení (obalení bičíku vrstvou mořidla, znásobení a zviditelnění jeho průměru) – elektronový mikroskop – negativní barvení otiskové preparáty po rychlém zmražení na -150 C Tvorba: • Samouspořádávání – molekuly flagelinu jsou středem vlákna transportovány na konec, vazba na konci bez enzymů, dosyntetizuje se vždy do stejné délky. Geny na stavbě: je jich asi 40, popsáno však jen 20. • Př. genů: HAP 1, 2, 3… Mechanismus chemotaxe E. coli • Regulace pomocí MCP systému Mechanismus chemotaxe – E.coli Regulace: • po koncentračním gradientu živin – regulována délka přímého a otáčivého pohybu za atraktantem • rozeznává serin, aspartát, maltózu, ribózu, galaktózu a dipeptidy, 200ms • proteiny lokalizovány v sériích, nejčastěji na tyčkovitých koncích E.coli: MCP systém – methyl – accepting chemotaxis protein. • Protein je řízen methylačním procesem • Systém je vázán na CM • vnitřní část proteinu v cytoplazmě, vnější ční ven • Na vnitřní část proteinu (CheW) se váží enzymy cytosolu (proteiny ChE, ChA) • na vnější se váže atraktant • Protein CheA - schopen autofosforylace v případě, že na MCP není navázán atraktant • Po vazbě atraktantu předává protein CheA fosfátovou skupinu proteinu CheB (methylesteráza) • CheB enzym: demethylace MCP systému • Protein CheB předává fosfátovou skupinu proteinu CheY – pohybuje se k bičíku, reakce s proteiny na jeho základně, následuje vrtivý pohyb bičíku (otáčení). Během 10s fosfát odstraněn pomocí CheZ • Autofosforylace CheA bez atraktantu • Jinak předání fosfátové skupiny a demethylace pomocí CheB • Bez atraktantu – rovnovážný stav mezi CheA a CheY – střídání vrtivého a přímočarého pohybu PILI - fimbrie • slouží k přenosu DNA konjugací, k přichycení fágů, různě velké, typicky u G- • struktura B.S • křehké, lámavé, různé morfologické typy –mnoho druhů • duté, vždy nepohyblivá trubička • jen G-, několik set • stavba: • 3, 4 nebo 5 vláken stočených do spirály • pilin - rodově i druhově specifický, lineární sekvence proteinových podjednotek • rozměry: • kratší než bičík, nejdelší je maximum podélné osy buňky, Ø2-8 nm, délka 0,1 – několik nm, 3-5 molekul • na celém povrchu či jen na určité části buňky • Hemaglutinace • inhibována manosou (MSHA) • neovlivněna (MRHA) • fce : • uchycení k povrchům (adheze k nenabitým povrchům: G- drží lépe na podložním sklíčku lehkou jemnou vazbou) • kontakt bakteriofága • twitching motility Příklady typů fimbrií: I. • kódované chromozomálně-specifická adherence • specifická kolonizace u symbiontů, parazitů a patogenů (koregulace s tvorbou toxinu u Vibrio cholerae O1, E.coli – uropatogenní P pilus, adherentnce fimbrie + enterotoxin E. coli –obojí kódováno plazmidem) II. • sex fimbrie - kódované konjugativním plazmidem u donora DNA – 1ks, můstek pro plazmid (F pilus u E.coli, konjugativní plazmidy salmonel) barvení : kys.fosfowolframová zachová podobu f., kys. osmičelová – f. ztlustí a zkrátí IV. „odskočení“ buněk streptokoků způsobuje „vroubkování“ kolonií • http://parts2.mit.edu/wiki/index.php/PROJECT_PROPOSAL • http://www.webcom.com/alexey/moviepage.html • www.bact.wisc.edu/.../structure.html • www.arn.org/mm/mm_movies.htm - animace, pohyb bičíku • http://focosi.altervista.org/physiobacteria.html • www.sedin.org/mol_museum.html Děkuji za pozornost