Přednáška č. 2 Mikroskopické techniky „The role of the infinitely small in nature is infinitely large" Louis Pasteur Buňka minimální jednotka strukturní, funkční a reprodukční • Vývoj buněčné teorie rozvoj mikroskopie (17. století až současnost) Jan Evangelista Purkyně (1787 –1869) mezi prvními na světě přisoudil buňkám jejich stěžejní význam pro život Matthias.J. Schleiden (1804-81) a Theodor Schwann (1810-82) 1839 buněčná teorie: Vývoj živé přírody se opírá o růst a tvoření buněk, buňky rostlin a živočichů se shodují tvarem a funkcí. Buňka je základní, stavební a funkční jednotkou živých organismů. Rudolf Virchow (1821-1902) „nové buňky vznikají jen dělením z již existujících“ L. Pasteur (1822-85) fermentace, popřel teorii spontánního tvoření buněk rozvoj biochemie 1.pol.20.stol 1953 struktura DNA (Watson, Crick,Franklinová) Zvláštnosti prokaryotické buňky • živý, otevřený systém schopný regulace a autoreprodukce • jádro neodděleno od CPL membránou, větš. kruhová (i lineární) DNA • haploidní buňky (1 alela) množící se nepohlavně • bez buněčných organel, jediná membrána je cytoplasmatická • ribosomy se liší od ribosomů eukaryotních buněk – menší, volně v CPL vyjma Archea: 5S, 16S a 23S rRNA translace začíná N-formylmethioninem geny pro RNA bez intronů specifické struktury a vlastnosti bakt. buňky: peptidoglykan (až na mykoplasmata) steroly v membránách zcela výjimečně bičík – globul. bílk. flagelin, pohyb rotací anaerobiosa, schopnost vázat N tvorba kyseliny PHB (zásob.l.) pokud fotosyntéza - anoxigenní Velikost a tvary bakteriální buňky velký poměr povrchu k objemu – velká plocha kontaktu buňky s prostředím • Velikost bakt b. v µm Chlamydia 0,3 x 0,3 Bdellovibrio 0,8 x 0,3 Rickettsia 1 x 0,3 S. aureus 0,8-1 x 0,8-1 E. coli 2-3 x 0,4-0,6 B. subtilis 1,8-4,8 x 0,9-1,1 Streptomyces vlákno x 0,7-1,6 Chromatium 25 x 10 Spirochety 500 • Tvary bakt. buňky Koky - sférické, oploštělé, lancetovité - diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, stafylokoky Tyčinky – rovné, zakřivené, větvící se, palisády pleomorfní Kokobacily Pupeny Prostéky Spirily Hvězdice Mycelia Morfologie kolonií Mikroskopie • Pojmy a schémata mikroskopie • A) Optická - zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí viditelného světla 1) Varianty optického mikroskopu 2) Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně např. absorbcí UV i IR světla • B) Elektronová • C) Akustická Robert Hook 1665 Již olejová lampa Optická (světelná) mikroskopie Max. zvětšení 1500 X, max. rozlišení 200 nm Stavba světelného mikroskopu • - mechanické součásti - stativ, noha, tubus, revolverový měnič objektivů, stolek, makro- a mikrošroub • - optika mikroskopu (objektiv a okulár) – kombinace čoček, korekce vad • - osvětlovací zařízení - světlo prochází objektem - zdroj světla: lampa v noze s kolektorovou čočkou kondenzor – ze 2-3 spojených čoček - soustřeďuje světelné paprsky na objekt Základem mikroskopu jsou dvě soustavy čoček: 1) Objektiv – vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz pozorovaný okulárem jako lupou. Výsledkem je neskutečný, zvětšený a převrácený obraz. - čím kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím větší je zvětšení 2) Okulár – zvětšuje obraz vytvořený objektivem, zvětšení je prázdné. Koriguje zbytek vad. a) jeden – mikroskopy monokulární b) dva – binokulární (Carl Zeiss 1933), světelný svazek rozdělen hranolem na dva Na základě vlastností světla v prostředí vzniká obraz Pojmy mikroskopie Rozlišení - jak daleko musí být od sebe dva body, aby nesplynuly v jeden • Pracovní vzdálenost - od povrchu čočky objektivu po krycí sklo • Kontrast - rozdíl ve vizualizaci objekt / pozadí Optické vady (aberace) objektivů: • Otvorová vada (kulová, sférická) Čočky objektivu nejsou tenké: různý lom paprsků od optické osy Bodový předmět zobrazen jako úsečka • Barevná vada (chromatická) Je způsobena optickou disperzí (závislost indexu lomu na vlnové délce světla). Bodový předmět zobrazován na různá místa optické osy v závislosti na vlnové délce světla. Okuláry – typy dle účelu mikroskopie • Huygensův • Ortoskopické – nezkreslují zorné pole, přesně stejné zvětšení v celém zorném poli. Zejména k měřicím účelům. • Kompenzační – kompenzují zbytkové chromatické vady. • Periplanatické – odstraňují astigmatickou vadu silněji zvětšujícich objektivů. • Brillovy – dioptrické • Širokoúhlé – průměr zorného pole až 2,5 cm • Projektivy - mikrofotografie Varianty optického mikroskopu • 1) Mikroskopie v temném poli – pro zvýšení kontrastu - preparát silný pro průchod paprsků - pozorování v odražených paprscích - upravený kondenzor osvětluje preparát zespodu (čočka uprostřed zacloněná) – objekt svítí • 2) Stereomikroskopie – 2 mikroskopy se samostatnými objektivy a okuláry - jejich optické osy svírají určitý úhel - plynulá změna zvětšení bez zaostření (operační mikroskopy) • 3) Mikroskopy pro mikrofotografování, pro pořizování videozáznamu s digitálními kamerami, projekční mikroskopy, mikroskopy s mikromanipulátory Speciální optické mikroskopy zobrazení struktur lišících se vzájemně absorbcí např.UV, IR světla • fázově kontrastní mikroskop 1953 – Nobelova cena za objev – Frits Zernike (1888 – 1966) • interferenční mikroskop - diferenční interferenční kontrast dle Nomarského (DIC) • polarizační mikroskop • UV mikroskopie • fluorescenční mikroskop Fázový kontrast I. Fázový kontrast II • Princip: V kondenzoru - kruhová clona (zatemnělý střed) Paprsky projdou vzorkem - na fázových objektech dojde k odchýlení některých paprsků z původního směru (vlivem ohybu, rozptylu, lomu). V objektivu - čtvrtfázová destička, také tvar mezikruží. Na ni dopad paprsků, co nezměnily směr při interakci s fázovými objekty, ty posunuty, ostatní paprsky (se změněným směrem) destičku minou, nejsou posunuty. Fázový kontras II. Obraz je vytvářen interferncí paprsků fázově posunutých i neposunutých • Pozitivní fázový kontrast: objekty tmavší vůči pozadí (fázově posunuty paprsky se změněným šířením) • Negativní fázový kontrast jsou-li objekty oproti pozadí relativně světlejší (fázově posunuty paprsky nevychýlené ze svého směru) Interferenční mikroskop • Princip: pracuje se 2 koherentními (interference schopnými) paprsky, 1. prochází objektem 2. vedle objektu Výhoda: možnost přímého měření indexu lomu objektů. • Princip: svazek polarizovaného světla je po průchodu preparátem štěpen polarizačním filtrem na 2 nepatrně posunuté svazky (nastává dvojlom). Takto se vytvoří i dva nepatrně posunuté obrazy, navzájem „kolmo polarizované“. Oblasti obrazů s fázovým posunem (způsobeného fázovými objekty preparátu) se přesně nekryjí a místa překryvu různého fáz.posunu jsou interferencí zviditelněna změnou jasu či barevným obrysem, v závislosti na použití monochromatického / polychromatického světla. Polarizační mikroskop • zviditelnění opticky aktivních nebo dvojlom vykazujících struktur • Princip: spojení konvenčního mikroskopu a polarimetru. • Optickou aktivitou se projevují i některé složky cytoplazmy i proudění cytoplazmy. UV mikroskopie • Princip: optika mikroskopu musí být z křemenného skla (dobře propouští UV). Obraz nepozorujeme okem, je zviditelněn na luminiscenčním stínítku a je fotografován. • Kratší vlnová délka UV = vyšší rozlišovací schopnost, té obvykle ale dosaženo není. Optika má korigovány vady pro jedinou vlnovou délku – takovou, co je přítomna ve zdroji UV záření. • Výhoda: přímé pozorování struktur propouštějících viditelné, ale pohlcujících UV světlo (bílkoviny, DNA). Fluorescenční mikroskop Využívá schopnosti některých látek po ozáření světlem o kratší vlnové délce emitovat viditelné světlo o delší vlnové délce. Využito dlouhovlnné UV a přilehlá oblast viditelného spektra emitovaného halogenovými lampami. UV světlu je přizpůsobena optika kondenzoru, zbytek optického systému totožný s běžným optickým mikroskopem. Přidány filtry (bariérový) chránící lidské oko před zbytkovým UV. Fluorescenci vykazují: někt. složky živé hmoty i bez obarvení (látky s aromatickým jádrem či heterocyklem – např. amk. tryptofan), většinu preparátů však barvíme fluorescenčními barvivy na zákl. specifické interakce s buněčnými strukturami. Mnohdy je fluorescenční barvivo (fluorochrom, fluorescenční sonda) navázáno na protilátku specifickou pro určitou bílkovinu v cytoplazmě, tak lze selektivně zviditelnit složky cytoskeletu eukaryotických buněk, chromatin, membránové bílkoviny apod. Schéma a princip fluorescenčního mikroskopu Optické mikroskopy vytvářející obraz postupně, z jednotlivých bodů (pixelů) = nesou informaci z úzkého světel.paprsku: 1.laserový řádkovací ( rastrovací, skenovací) konfokální mikroskop §Rušivé světlo z vrstev nad a pod rovinou ostrosti odstraněno z dráhy k detektoru zábranou s malým otvorem – výsledek: perfektně ostrý obraz. Paprsek se po objektu posouvá a obraz jednotlivých bodů se skládá v PC. Posunem paprsku do jiné hloubky lze vytvořit optické řezy a skládat je do 3D obrazu. §Význam: možnost pozorování i relativně silných preparátů, včetně nativních. §Konfokální mikroskop lze upravit i pro konfokální fluorescenční mikroskopii 2. barevný řádkovací mikroskop „s letící stopou“ § místo mechanického řádkovacího systému používá jasnou bílou světelnou stopu, která přebíhá po řádcích na obrazovce osciloskopu. § Výhody: výborné rozlišení, vysoký kontrast (úpravou jasu zdrojové světelné stopy v závislosti na absorbanci preparátu) 3. optická skenovací mikroskopie v blízkém poli NFOS § velmi úzký světelný paprsek prochází po řádcích velmi tenkým preparátem a jsou měřeny změny jeho intenzity. § Výhody: rozlišení 10 –100x vyšší než u klasického světelného mikroskopu. Výhodou oproti elektronové mikroskopii (viz dále) je, že vzorek nemusí být umístěn ve vakuu ale lze jej pozorovat např. ve vodném prostředí. Elektronová mikroskopie (EM) • Zobrazení předmětů pomocí urychlených elektronových svazků – elektrony mají vlnovou délku de Broglieových hmotnost.vln • Urychlením lze dosáhnout stotisíckrát kratších vlnových délek: Rozlišovací schopnost pak (σ= λ /n*sinα): velmi malá λ • Vlivem velkých optických vad použitých čoček (magnetické) poměrně malá numerická apertura – řádově setiny. Rozlišovací mez: desetiny nm (mlk) Transmisní elektronový mikroskop (TEM) • V biologické praxi: Z 5 000 - 100 000 × rozlišení: desetiny nm (větší molekuly) • Struktura objektu: průchodem el.svazku • Elektronový paprsek: ze žhaveného kovového vlákna • Proti rozptylu elektronů: v tubusu EM vysoké vakuum • Čočky vytvářeny obvykle rotačně symetrickým elmag. polem • Konečný obraz pozorujeme nepřímo, projekcí na luminiscenční stínítko Procházející elektrony se zachycují a obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropuštějí elektrony na příklad uranyl acetát, molybdenan amonný. Rastrovací elektronová mikroskopie (skenovací, řádkovací, Scanning Electron Microscope - SEM) • velmi úzký paprsek elektronů je vychylovacím systémem nucen přejíždět po povrchu preparátu po řádcích • Rozlišovací schopnost SEM o 1-2 řády menší než TEM, ale možnost pozorování objektů s komplikovanou 3D strukturou (signál totiž nese informaci o sklonu povrchu v místě dopadu svazku elektronů) výsledkem je obraz s vysokou hloubkou ostrosti Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu), tence potaženého paprskem iontů kovu, například platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem, v místech, kde se kovové ionty nedostanou vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz. Skenovací tunelová elektronová mikroskopie (scanning tuneling electron microscopy, STM) § Nad povrchem preparátu se pohybuje velmi tenký kovový hrot, ke kterému „tunelují“ elektrony z povrchu preparátu (tunelový efekt – jev kvantové mechaniky, kdy částice pronikají oblastí, na překonání níž by dle zákonů klasické mechaniky neměli dostatek energie) § Zobrazuje se elektronová hustota na povrchu preparátu s rozlišením na úrovni rozměrů atomů. § Výhody: Vzorky nemusí být ve vakuu, ale např. i ve vodném prostředí. Akustická mikroskopie • Hyperzvuk proniká v kapalinách i pevném prostředí do hloubky jednotek až desítek mikrometrů. • Pozorování preparátů neprostupných pro elektrony a viditelné světlo. • Informace o mechanických vlastnostech prostředí. Barvení buněk • Gramovo barvení – barvení bakterií jako identifikační metoda • Hans Christian Joachim Gram (1884) 1)Bazické barvivo --- 2)voda ---- 3)Lugolův fixační roztok --- 4)voda --- 5)aceton, ethanol --- 6)voda --- 7)safranin (dobarvení) Obrazová dokumentace a zpracování obrazu • Zařízení • Komprese a formáty obrazu • Pojmy • Programy - analýza obrazu (LUCIA) Zajímavé adresy a odkazy • http://www.gate2biotech.cz/nejdokonalejsi-elektronovy-mikroskop-ve-sluzbach-ustavu-molekularni-gene tiky-av-cr/ • http://micro.magnet.fsu.edu/cells/bacteriacell.html • http://www.micro-scope.de/toc.html • http://w3.uniroma1.it/MEDICFISIO/microscopy.htm • http://www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Zdroje: – Campbell N.A. a kol. (2006): Biologie, Computer press, Brno – Čech S. a kol. (1998): Histologická praktika a metody vyšetřování tkání a orgánů, LFMU, Brno – Hrazdira.I., Mornstein V. (2001): Lékařská biofyzika a přístrojová technika, Neptun, Brno – Rosypal a kol. (1999): Úvod do molekulární biologie, Brno