Růstové cykly bakterií Růstové cykly bakterií II. Střídání přisedlé a volné (plovoucí) formy života u prokaryot Caulobacter crescentus Sphaerotilus natans Biofilm • Charakterizace mikrobiální fyziologie: byly studovány planktonní buňky nebo buňky biofilmu? – v přírodě existence většiny bakterií ve formě biofilmu, planktonní buňky se vyskytují jen ve fázích přechodu do biofilmu druhého • Studie: Sbírkové kmeny? Z prostředí? • Jaké vlastnosti musí mít bakteriální povlak, aby byl za biofilm označen? - nově proti původní definici: struktury a závoje vznikající i bez přítomnosti pevné podložky… Biofilm / mikrokolonie: husté mikrobiální populace vyvinuté z volně plovoucích (planktonických) buněk usazených na vhodném povrchu v matrix z polysacharidů formujících „hřibovité“ útvary s dutinkami, kanálky a stopkami. Je zodpovědný za 65% onemocnění západního světa. • Biofilm jednoho bakteriálního druhu má jednodušší stavbu než společenství více druhů Studium – větš. u G- • počalo u polysacharidové glykokalyx • mikroskopie: - světelný mikroskop: obtížné - elektronový: nepracuje se živými buňkami - konfokální: dovoluje prohlížet plochy ve zvolené hloubce, z řezů pak skládána struktura; časosběrná metoda: možno získat záznam dění v biofilmu - řádkovací elektronoptická technika… Jak biofilm vzniká.. Vlastnosti a změny buněk při vzniku biofilmu • Přilnutí: - spouští se řada genů - uplatňují se bičíky – při dotyku jejich syntézy - v hotovém biofilmu mizí - u G- bakterií fimbrie (=pili) - 1 μm dlouhé; stovky - některé salmonely a E. coli – zvl. typ fimbrií z neobvyklé bílkoviny amyloidu: curli (význam v patogenezi i při studiu patogeneze u Alzheimerovy choroby – model tvorby amyloidu) Zkumavka: stac. kultivace: plovoucí E. coli, bez usazování na skle Nádoba s přítokem živin: vzniká povlak s odlišnými buňkami – mutací změněna jediná AMK v regulační bílkovině genu pro curli Vznik biofilmu – přizpůsobení přisedlému způsobu života: Mechanismy adheze: adhesiny, fimbrie – curli, glykokalyx Reverzibilní – van der Waalsovy síly – slabé vazby buňka-povrch Irreverzibilní – chemická vazba (kovalentní, vodíková) - přítomnost extracelulárních polymerů Změna fenotypu - ustává syntéza bičíků, mukózní látky Ps. aeruginosa – alginát Spouštěcí podněty: • Osmotický tlak • Snížený obsah kyslíku • Rostoucí hustota poulace - quorum sensing – malé mlk. pro maturaci biofilmu a virulenci např: acyl-homoserin lakton (G-), malé peptidy (G+) • Po přichycení změna vlastností: - zprvu na úrovni regulace genů (díky změně vnějších podmínek – - jiné osmotické poměry, kyslíku, hustota populace) - 1/3 bílkovin se produkuje v rozdílném poměru k bílkovinám planktonických buněk - více tvořeny bílkoviny 1) pórů, 2) transportní 3) syntetizující mimobuněčnou hmotu • Po přichycení nutno vytvořit matrici - z polysacharidu - př: P. aeruginosa - PS alginát, již 15 minut po přisednutí Početná populace…. • Signály - G+ - peptidy – řídí dělení buněk (= hustotu populace), tvorbu matrice (velmi trvanlivé; na povrchu i po odstranění biofilmu!) „quorum sensing“ – několik desítek genů tvořících signály - vznik bílkovin mnoha fcí – regulace, virulence (toxiny, enzymy) • Přenos genů - až 1000x úspěšněji než u buněk planktonických • Fenotyp buněk - rytmicky se mění - po odplavení si zachovají urč. dobu vlatnosti jako v biofilmu (R) • Odplavení - aktivace genu pro syntézu enzymu štěpícího matrici Pseudomonas aeruginosa formování biofilmu sestává z pěti kroků, během nichž exprese více jak 800 proteinů (tedy víc jak polovina proteomu tohoto druhu) je šest i vícenásobně zvýšená. Reversibilní přilnutí (attachment): buňky se přechodně fixují k substrátu a povrchem indukovaná genová exprese ústí do tvorby proteinového profilu zřetelně odlišného od planktonních buněk Ireverzibilní přilnutí: u buněk dochází k reorientaci, shlukování, ztrátě pohyblivosti a aktivaci regulonu quorum sensing Maturace I: buněčné shluky jsou silnější a je aktivován rhl quorum sensing system Maturace II: buněčné shluky dosahují maximální tloušťky s proteinovým profilem odlišným od planktonních buněk Disperze: změna struktury shluků, formování pórů a kanálků. Přítomnost pohyblivých i nepohyblivých buněk. Nový objev mikrobiologů v USA: nejen pevné povrchy, ale i v bujonu ve zkumavce po delší kultivaci, dříve než buňky klesnou ke dnu… • Síťovina z polymeru - hexagonální stěny kanálků, 150nm tlusté, ukrývají buňky • Kanálky vznikají z plochých struktur, které se tvoří v pravidelných periodických vzdálenostech • Na periferii tvoří buňky kompaktní závoje, které vlají v proudu kapaliny a tlumí střihové síly tekutého prostředí • Funkce síťoviny: lešení, asi i přenos signálu a ukazatel směru posunu buněk • Popsány i struktury vlákének spojujících jednotlivá místa síťky • Zatím nezodpovězené otázky: jakto, že buňky zaujímají seskupení destičky a ne amorfní kapky? • Jak to, že se řadí v pravidelných intervalech? • Co bakterie zastaví po dosažení 150ti nm tloušťky stěny? Quorum – sensing - regulace luminiscence u Vibrio fischeri Quorum - sensing • Soustava malých organických molekul, které jsou buňkou tvořeny v závislosti na koncentraci jich samotných v prostředí • Buňka tak reaguje na hustotu populace • Kaskáda reakcí po vazbě na receptor spouští syntézu sekundárních metabolitů a komunikaci v rámci bakt. společenstva • Vnitrodruhová organizace komunity P. aeruginosa: acyl-homoserin lakton (LasI/LasR and RhlI/RhlR) systém • Monitorování hustoty populace • Specifické receptory a syntetázy (Lux I) • Různé LuxI produkují různé formy ASHL • Liší se v R1 a R2 pozicích postranního řetězce • Koncentrace ASHL v buňce dána koncentrací těchto molekul v prostředí • Význam pro ekologii buněk ale i virulenci !!! Ekonomika buňky: produkce extracelulárních signálů až nad určitou hustotou populace !!! • Načasování rozmístění faktorů virulence v hostiteli je kritický bod – patogen se může hromadit bez vykazování faktorů virulence • Více než 4% z téměř 6 000 genů P. aeruginosa regulováno pomocí quorum - sensing • Žluté diamanty v kruhu: LuxR homology aktivované HSL signálem – jeho difuze do a ven z b. • Šipky: qsc genes. • Substrát pro HSL syntázu je acetylovaný acyl-karyl protein (Acyl-ACP) a S-adenosylmethionine (SAM). • Nízká hustota populace produkuje určitou kvantitu ASHL molekul • Různé transkripční faktory gsc genů jednotlivých cyklů jsou aktivovány různými formami ASHL po dosažení jejich určité koncentrace • Kaskáda reakcí pro spuštění produkce sekundárních metabolitů: HCN, pyocyanin • Acyl-homoserin lakton (G- bakterie) = autoinduktor (červený) a metabol.produkt od urč.koncentrace AHSL (zelený) Quorum response in gram-postitive bacteria. Zvýšení uvolňování buněk ze zralého biofilmu Zvláštnosti biofilmu Přenos genů mezi buňkami až 1 000x větší Vyšší rezistence k ATB a dezinfekci (H202, chlor) - omezená difúze - sorpce ATB - klidový stav, hladovění - změna genotypu: geny mar – multiple ATB resistance - efflux systém - enzymatická degradace - modifikace cílových mlk Speciální sigma faktory Signální mechanismy Zubní povlak – A. van Leewenhoek - periodontitida Střevní sliznice Infekce – sliznice nebo uvnitř tkáně; - endokarditida - trvalý biofilm na chlopních (hl. strepto- a stafylokoky; nebezpečí z krvácivých dásní..) - rány; bércové vředy; spáleniny Chronické infekce – dýchací cesty Cystická fibróza – genet. onemocnění (porucha iont. rovnováhy) Vývoj: běžné infekce (stafylokoky, hemofily, pneumokoky) později na poškozené tkáni P. aeruginosa; v alginátu odolné. CHOPN - ušní infekce - močové cesty - chronický zánět prostaty Cévky – arteriální, žilní Močové katetry Dýchací a dializační přístroje Umělé chlopně Kontaktní čočky Děložní tělísko Nemusí být kontakt s vnějškem! - kovové náhrady kloubů • Lékařská mikrobiologie: Pg bakterie biofilmu nelze testovat na rezistenci k antibiotikům – vykultivované bakterie jsou již planktonické = s jinými vlastnostmi! Terapie biofilmů Studium mutací genů gsc = studium narušení formování biofilmu – poté přístupnější ATB a dezinfekci Přisedlé bakterie • Každé buněčné dělení je asymetrické – vznikají dvě morfologicky odlišné buňky Pro replikaci buňky nutné přisednutí na místo s vhodným substrátem a diferenciace ve stélkatou buňku. Poté iniciace replikace DNA. Sphaerotilus natans G- tyčky, medium 12 • Tekoucí vody • Papírenské vody • Kaly • Aktivované kaly – problém sedimentace • Degradace pochev – Bacillus - enzym Sphaerotilus natans Sphaerotilus natans Sphaerotilus natans Micromonosporaceae, Actinoplanes sp. Pilimelia columellifera (by G. Vobis) Zdroje: Schindler J. (2008): Ze života bakterií, ACADEMIA, Praha • www.yale.edu/jacobswagner/research.htm • http://www.sciencedaily.com/releases/2006/04/060411222211.htm • biology.kenyon.edu/.../Chap11/Chapter_11A.html • http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/16/8789 Děkuji za pozornost