Růstové cykly bakterií Jednoduché růstové cykly • Důvodem je adaptace či příprava (u sporulace) na změny podmínek životního prostředí • U parazitů: přechod z prostředí těla vyšších organismů ven Jaké buněčné formy v doménách Bacteria a Archaea rozeznáváme? • rostoucí a dělící se vegetativní formy buněk • struktury dovolující přežití nepříznivých podmínek (cysty odolné proti dehydrataci, ne však proti horku - Azotobacter, Myxococcus, Sporocytophaga, kdy je celá buňka obklopena protektivní vrstvou nad buněčnou stěnou) • rody Metylosinus and Rhodomicrobium vytváří termostabilní exospory. • Konidie - termosenzitivní asexuální reprodukční struktury produkované různými rody aktinomycet • endospory - odolná klidová nereproduktivní stadia s několika vyjímečnými charakteristikami Vegetativní a klidové stadium Tvorba spor • převážně G+ bakterie – termorezistentní endospory Bacillus (aerobní tyčky), Clostridum, Thermoactinomyces a Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces • Výjimečně i G– bakterie (Coxiella burnetii, původce Q-horečky). • G- bakterie – exospory Méně rezistentní, odolné zejm.vůči vysychání Azotobacter, Methylosinus Azotobacter – pouzdra, cysty • Oproti doméně Eucarya v buňce přítomna pouze jedna endospora • Peptidoglykan v kortexu spory je zcela jiného charakteru než peptidoglykan samotné buňky vytvářející sporu • Stabilizace makromolekul ve spoře: přítomností specifických bílkovin, dále ztrátou vody a její náhradou vápníkem (pouze zde přítomna v přírodě unikátní kyselina dipikolinová) • Vysoká odolnost napomáhá přečkat podmínky nevhodné pro život i po tisíce let (?); jsou prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí. • Tvorba endospory však není odpovědí na prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky. • Odolné k působení UV a γ záření, vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků. V ethanolu mohou přežívat několik měsíců. • Sporicidní látky: ethylenoxid, β-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin. • Jednou odstartovaný proces sporulace již nejde zastavit – regulace v uzlových bodech • Asporulační medium – glukóza Pozorování endospor • Pozorovat neobarvené endospory můžeme fázovým (zářící spory) a Nomarského kontrastem (plastický povrch buňky); • Jednoduchým barvením nezvýrazníme spory samotné, jen vyklenutí buňky (způsobené jejich přítomností). Strukturální barvení endospor • Diagnostické Gramovo barvení určí G+ a G- typ buněčné stěny; souběžné strukt. barvení spor u suspektních sporulujících druhů zvýrazní: • Tvar, velikost a umístění spory v buňce je dalším charakteristickým znakem napomáhajícím identifikaci. • Př: vždy oválné spory B. cereus, B. anthracis, Clostridium botulinum, kulaté spory Clostridium tetani či B. sphaericus, cylindrické či elipsoidní spory dalších druhů. • U velikosti spor hodnotíme, zda a kde vyklenuje buňku. • Spory se velmi těžko barví i po fixaci • Chceme-li spory obarvit, musíme použít koncentrovaná barviva za tepla nebo různá mořidla. • Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (př. alkoholem), čehož se využívá k diferenciaci spor. • Barvitelnost spor záleží na: - jejich vývojovém stádium - stáří kultury - kvalitě živné půdy - individuálních vlastnostech mikrobů • Barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií (s přídavkem manganu nebo urey). Uložení v buňce: • terminální = na konci tyčinky C. tetani (jakoby paličky), B. stearotermophilus • centrální (C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, B. anthracis, B. cereus) • subterminální = paracentrálně = = mezi středem a pólem buňky, nejčastěji (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis) • Rozšíření buňky: C. botulinum, C. tetani, Bacillus stearothermophilus • mírné rozšíření: C. histolyticum a C. novyi • U některých druhů spora buňku nezduřuje: B. anthracis, B. cereus. Klinicky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium Clostridium botulinum: • sporulující buňky odolávají 2-6 hodin teplotě 100 °C • oproti nesporulujícím, které hynou po 30' při 70 °C! • Spory inaktivovány po 20' při 121 °C vodní páry při • 2 atm (0,2Mpa) a po 90´ - 180' při 160 - 200 °C suchého tepla, vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var v Clostridium tetani – tetanus. Ke zničení spor nutno působit 100°C po 90 minut. v Bacillus anthracis – biologická zbraň, anthrax v • biopesticidy - Bt toxin transgen – Bacillus thuringiensis var. israelensis Bacillus anthracis Proces sporulace • Začíná ve fázi G1 přechodem od binárního k asymetrickému dělení • probíhá i při dostatku živin, hlavně však ve stacionární fázi Fáze 0 Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází v G1 od binárního k asymetrickému dělení. Fáze I • Tvorba axiálních filament k • rozdělení bakteriálního chromozomu. • Sporogenní zóna – jiná hustota b.mat. Fáze II • ukončena replikace buněčného genetického materiálu, a ten se následně rozestupuje k pólům buňky. Končí invaginace cytoplazmatické membrány. Fáze III • proliferace cytoplazmatické membrány kolem obou vydělených částí buňky, u spory dochází k zaobalení (prospora - barvitelná) • Intina. extina Fáze IV Tvoří se kortex spóry s PG o složení líšícím se od peptidoglykanu buněčné stěny • Ve spóře obsažena kyselina dipikolinová (stabilizuje kvarterní strukturu DNA ve vazbách) a velké množství Ca^++ iontů – aktivní transport - antiport. Fáze V • Syntéza pláště. • Vícevrstevný. • Již minimum vody. • U rodu Bacillus: Vzniká exosporium složené z deseti proteinů, polysacharidů a lipidů. Fáze VI • Maturace endospory a lyze mateřské buňky, uvolnění zralých spór Fáze VII • Volná zralá spóra. Stavba zralé spory • Jádro – představuje gelovou matrix, tvořenou bakteriálním jaderným ekvivalentem – nukleoidem, kalcium dipikolinátem (CDPA) nebo pyridin-2,6-dikarboxylovou kyselinou, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury DNA • Kortex 1) vnitřní kortex (20% kortexu) či stěnu spóry 2) zevní kortex (80 % kortexu). • Zajišťuje nepropustnost (nebarvitelný!) • Kortex tvořen peptidoglykany (PG). Jen 20-30 % PG jednotek shodných s jednotkami v buněčné stěně. • Zbylých 50-60 % N-acetylmuramyl–laktam, • dalších 18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu. • Tyto modifikace zajišťují enzymy: membránově vázaná Glu-mesoDmp hydroláza a cytosolová Ac-Ala-Glu-mesoDmp lyáza. • · Perikortikální membrána • · Pláště složené z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost spór k působení chemikálií. • výše zmíněné exosporium u rodu Bacillus Jedinečné a charakteristické struktury spory • Kalcium dipikolinát • Proteiny stabilizující DNA • Kortex • DNA reparační enzymy v procesu germinace Germinace spory – terminální, centrální • Germinací rozumíme rychlý proces klíčení spory. • Začíná spontánní aktivací spory • Aktivace – destabilizací pláště – působením teploty 70-85 °C po 5 – 10 min, další aktivátory: malé organické molekuly, L-Ala, Ado a Ino, vyšší obsah bazí V laboratořích zahřátí v přítomnosti vody. • Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí rezistenci – bílkoviny se začínají rozkládat vzniklé AMK - stavební kameny nových proteinů • Lytický enzym: p68 => p29 (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. • Po dvou hodinách po germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky. • Inhibice klíčení: D-Ala, MgCl[2], PMSF Exospory = cysty • Nejsou tolik rezistentní vůči teplu • Rezistentní vůči vysychání • Granula PHB – typická pro cysty • Odlišné obaly – algináty, různé polysacharidy • Nejpodrobněji popsány u Azotobacter vinelandii, - mnohovrstevný obal (vnější části vyšší hustota), unikátní lipidy • Za příznivých podmínek cysty klíčí a mění se ve vegetativní buňky