Fyziologie kmenových buněk
Jiří Pacherník
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116
Podpořeno FRVŠ 540/2007
Dělení buněk (proliferace)Dělení buněk (proliferace)
Symetricky ­ vznikají dvě identické buňky
Diferenciační dělení ­ obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším
stupněm v dané diferenciační linii
Asymetricky ­ jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná
Diferenciace (rozrůzňování) buněkDiferenciace (rozrůzňování) buněk
- Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů.
- Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?).
Kmenová buňka
aktuální <-> potencionální
Terminálně
diferencovaná buňka**
** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí.
Ne všechny terminálně diferencované buňky
jsou post-mitotické.
* Často proliferují a mají schopnost
krátkodobé sebeobnovy.
Přechodně/transientně
se dělící buňky (Progenitory)*
Diferenciace buněk
přestavba genomu / chromatinu ­> exprese jiného paternu genů ­> jíná morfologie,
jiné funkce a potenciál
geny a jejich produkty
- ,,houskeeping" (metabolismus, transkripce / translace, základy cytoskeletu)
- všeobecně abundantní (transripce/translace, cytoskelet, komponenty signálních drah)
- specifické (enzymy, specifické transkripční faktory, cytoskelet ­ komponenty
intermediálních filament, s cytoskeletem asociované proteiny)
Determinace ­ předurčení pro danou diferenciační linii / dráhu
Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na:Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na:
Totipotentní ­ mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu
Pluripotentní ­ mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy)
Multipotentní ­ může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady
(Oligopotentní ­ podobné jako multipotentní, ale méně typů)
Unipotentní ­ dávají vznik jen dvěma typům buněk
Nullipotentní ­ mohou se pouze dělit, nemění fenotyp
totipotentní
buňky
pluripotentní, multipotentní, ....
buňky
Totipotentní buňkyTotipotentní buňky
- 1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci)
- Omezené možnosti dělení (neprobíha transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.)
- Existují pouze přechodně
http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization
Ztráta totipotence v průběhu časné embryogeneze
- vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk
- tento proces je ireverzibilní
M ­ meridiální / E - ekvatoriální
Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer
Magdalena Zernicka-Goetz 2006
Orientace blastomer 4-buněčného embrya
a její vliv na zachování absolutní totipotence
těchto buněk
Pluripotentní buňkyPluripotentní buňky (savci)
a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy
buňky epiblastu / primitivního ektodermu
buňky nerální lišty (4tý zárodečný list)
kmenové buňky teratomů (???)
(somatické kmenové buňky?)
b) In vitro: embryonální kmenové buňky
embryonální zárodečné buňky
embryonální nádorové buňky
(kmenové buňky teratomů)
(somatické kmenové buňky?)
Boiani & Scholer 2005
Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,...
ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové.
(Pleopotentní buňka)
pluripotentní buňka
multipotentní
tkáňově specifická buňka
multipotentní
tkáňově specifická buňka
Pleopotence
(změna v determinaci)
Pleopotence*
terminálně diferencované buňky
progenitory
*
Schopnost sebeobnovy = self-renewal
Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence /
multipotence / .....
=> kmenovost = stemness
- Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp /
relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické
proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...)
= VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY
- Některé somatické, terminálně diferencované buňky si zachovávají schopnost
sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálně jsou ale quiescentní
(spící)
= FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY
- Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost
proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni
= Sebeobnovující se diferencované buňky
KMENOVÉ BUŇKY
- dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu)
- relativně pomalá proliferace
- jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní
- jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi
- mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení
- s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí
profesionální SC
- v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, ,,niche" (koutek)
- mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery,
specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...
- ???
KMENOVÉ BUŇKY PRIMÁRNÍ = existují ,,in vivo"
Somatické kmenové buňky (embryonální a adultní)
Buňky některých zárodečných linií (neurální lišta) a kmenové buňky trofoblastu
KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen ,,in vitro"
- jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze
zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání
- relativně rychle proliferují
- některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé
pluripotentní (embryonální původ)
- mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu
- mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = ,,asymetrické/symetrické" dělení
- mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery,
specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...
- ???
Embryonální kmenové buňky
-> odvozené z vnitřní buněčné masy
(Kmenové buňky epiblastu)
Embryonální zárodečné buňky
-> odvozené z primordiálních zárodečných buněk
Embryonální nádorové buňky
-> odvozené z kmenových buněk teratomů
Somatické kmenové buňky odvozené
-> odvozené ze somatických kmenových buněk
Vybrané signální dráhy
Signální dráha LIF (leukemii inhibující faktor) -> gp130 signalling
Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních
a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophily)
Boiani & Scholer 2005
Význam gp130 signalizace v průběhu embryogeneze
Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory)
Bottcher a Niehrs, 2005
Signální dráha TGFb / BMPs
(Transformující růstový (growth) faktor b
kostní (bone) morfogenetické proteiny)
CROSSTALK FGF & TGFb DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU
Potlačení sérového BMP přidaným FGF-2 => inhibice diferenciace hES
Massague, 2003
Signální dráha Wnts
Wnt
+
http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html
Signální dráha Wnts
Signální dráha Hedgehog
sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh)
off
off
on
on
Ptc ­ Patched Smo - Smoothened
Signální dráha Notch
a) b)
a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání ligandu (DSL rodina = Delta,
Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně
i intracelulární (NICD ­ Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru
s CSL (= CBF1 ­ Cp binding factor 1) aktivuje transkripci.
b) dráha snad aktivovaná dosud neznámým faktorem, kdy dochází k aktivaci proteinu
Deltax, který pak inhibuje JNK a CBP/p300 aktivitu.
Brennan 2003
Signální dráha Notch
Boghog 2; Wikipedia
Signální dráha jaderných receptorů obecně
Signální dráha jaderných receptorů
DNA
DNA
transkripce
transkripceTF
sebeobnova x diferenciace
?differenciace x sebeobnova?
TF
NR
NR NR
NR
NR
ligandy
jaderné (nuclear)
receptory
transkripční
faktory
Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell ­ ESC)
Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell ­ EGC)
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell ­ ECC)
Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell ­ EpiSC)
Early-primitive ectoderm-like - EPL
ESC
ECC
EGC
Pluripotentní, odvozené kmenové buňky
EPL
EpiSC
Embryonální kmenové buňky
(Embryonic stem cell)
ESC
- jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty
- fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC,
ICM ­ inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC)
- jsou pluripotentní
- přirozeně neexistují, pouze in vitro
- jsou nesmrtelné
- mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?)
- po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy
(důkaz pluripotence)
- po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry
(známo jen u mESC, důkaz pluripotence)
Gilbert 1997 / Bílek 2004
Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy
3,5 dní p.c.
ICM
Linie ES buněk na feederu MEF
4-5 dní
Fibroblastová výživná vrstva
,,feeder"- tvořená MEF
TE
Odstranění
PEF
Homogenní populace ES buněk
Vyseknutí a
disociace ICM
Izolace myších ES buněk
Upraveno podle Kroupová 2004
Imuno-chirurgie
6-8 ddnů IVF
TERATOM
CHIMÉRA
Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů
Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce)
Jsou směsí geneticky odlišných buněk na ůrovni všech tkání, a tak také vytváří
pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce!
Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou
všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po
terminálně diferencované
Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a
testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní
(teratokarcinom)
Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádorové buňky
(Embryonal carcinoma (EC) cells)
Růst a kultivace ES buněk
PROLIFERACE ­ DIFERENCIACE - APOTÓSA
Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších
(extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně
syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto
faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory
si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu.
FEEDER
- výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad
- nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF))
- bez ,,feederu" z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky
- tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, ...
- MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami
- MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky,
matrigelem,..., obecně definovanějšími preparáty
Důlëžitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra,
které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá
tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení).
- ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit
- diferenciace je často spojena s apoptózou
- vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat
- faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů,
ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu!
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
A B
Obecný model inhibice diferenciace ES buněk
feeder
(výživná vrstva)
auto- a parakrinně působící factory
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
LIF* BMP-4
(BMP-2
/BMP-12
/FCS nebo SR*)
LIF ­ leukemia inhibitory factor
BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12
FCS ­ fetal calf serum
Model inhibice diferenciace myších ES buněk
- existují i linie mES buněk nezávislé na LIF
- zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?)
- mES buňky pěstované bez ,,feederu" ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo
- některé linie nelze bez ,,feederu" pěstovat vůbec
vlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší
z kterého byly izolovány!
FGF-4, Wnt
FGF-4 ­ fibroblast growth factor
SR ­ serum replacement
Feeder*
*ABSOLUTNÍ OPTIMUM
Boiani & Scholer 2005
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
FGF-2 Activin/Nodal
Noggin
Wnt
FCS?
Model inhibice diferenciace lidských ES buněk
+
MEF (feeder) nebo matrigel
?, Wnt, FGF-2, IGF
?
FCS ­ obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu
FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými
šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou
koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. SerumReplacement
( fy. Invitrogene-Gibco)
OPTIMUM???
Vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky
(pluripotentní embryonální buňky)
Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 ­ master of pluripotency)
- transkripční faktor, homeoprotein
- exprimuje se již u 2/4 (myš ­ aktivace transkripce) buněčného embrya
- ve stádiu blastuly je jeho exprese výrazně zvýšena
- ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM
- později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v zárodečných
buňkách), nízká exprese se předpokládá i v somatických kmenových buňkách ?!?
- nebyl nalezen u kuřat
- reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, ....
- v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell nuclear
factor, RA (retinoic acid),...
- V primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor
homologue 1)
Nanog
- transkripční faktor, homeoprotein
- jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4
- objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly
Sox-2
- Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein)
- Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi
- V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje
Pan2006
Boyer2005
Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2
Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3,
Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES.
Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé
jimi řízené geny u hES.
Promotory genů
Proteiny
Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna.
Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou
v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES.
Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu
v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. výše).
Promotorové sekvence
rozpoznávané Oct-4, Nanog
a Sox-2 u hES.
Ztráta pluripotence u ES buněk v důsledku
deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog
Chamber, 2004
Johnson 2006
ES BUŇKY
a) myší ES (mES) x b) lidské ES (hES)
(LIF / gp130* / STAT3 dependent) (LIF / gp130* / STAT3 independent)
Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít
skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza).
Rao, 2004
mESC PGC (h/m) EGC (h/m)
embryonální diapauza (myš / lasicovití)
gp130 signalling
dependent
somatické SC ??
hESC/mEpiSC
pluripotent multipotent a méně
mouse
Signální dráha gp130 ->-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši
+ mES
- hES / mEpiSC
- mES
+ hES / mEpiSC
Signální dráha TGFbeta / BMPs
Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk
Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát
proteoglycan, ITetraspannin transmembránové
proteiny, AP ­ alkalická fosfatáza,
EB ­ embryoidní tělísko, ESC ­ embryonální
kmenové buňky, SSEA ­ vývojově specifický
embryonální antigen (stage-specific embryonic
antigen), TRA ­ antigen odmítnutí nádoru
(tumor-rejection antigen), NR ­ nestudováno
(not reported)
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
EpiSC
- neintegrují se do moruly a blastocysty => rozdíl s mES
- netvoří kompletní chiméry
- nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP)
(mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP)
- EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Metylace DNA a kondenzace chromatinu u ES buněk
Meshorer & Misteli 2006
Epigenetika ES buněk
Bibikova, 2006
cancer cells differ. cell SSC hES
Profil metylace DNA u různých typů buněk (40 genů, 49 CpG míst)
Bártová, 20007
Změny v distribuci HP1 a TIF1b v průběhu indukce
diferenciace embryonal. pluripotent. buněk (EC P19)
V průběhu diferenciace pluripotentních buněk dochází ke kondenzaci chromatinu,
což je možno detekovat i v podobě výraznejších/kondenzovanějších chromocenter
(DAPI-modře kontrastovaná DNA) a akumulací s chromatinem asociovaných proteinů
(jako zde ukázaný TIF1b a HP1 proteiny)
do těchto oblastí. Současně dochází
také ke specifické asociaci mezi
jednotlivými typy HP1 proteinů
spojených s konkrétními diferenciačními
drahami.
CONTROL ­ nediferencované buňky
S-R a SF-R ­ různé typy diferenciací
TSA ­ inhib. Acetyltransferáz
5dAzaC ­ inhibitor metyltransferáz
Meshorer & Misteli 2006
Model změn trankripčního profilu v průběhu indukce diferenciace ES buněk
HA ­ model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) ­> metylace DNA
ETCM ­ model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks)
­> modifikace histonů
PT ­ model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription)
­> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu
Modifikace histonů ­ regulace transkripce
Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4
u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk
Dai & Rasmussen 2007
Dai & Rasmussen 2007
Změny histonových modifikací po působení TSA* u ES a MEF buněk
*TSA ­ Trichostatin: inhibitor deacetyláz
Polycomb group (PcG) x Trithorax group (trxG) proteins
PcG jsou odpovědné za inaktivaci transkripce cílových oblastí
trxG jsou odpovědné za aktivaci transkripce cílových oblastí
- obecně patří mezi skupinu proteinů modifikujících chromatin
- regulují zejména transkripci homeotických genů ­ význam v ontogenezi
- jsou odpovědné za epigenetickou pamět genomu
- rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA
PRE ­ PcG responsive element
TRE ­ trxG response element
- jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou
(PcG 4 základní skupiny komplexů), specifita těchto komplexů
k daným PRE/TRE je dána dalšími asociujícími specifickými podjednotkami
Proliferace ES buněk
S laskavým nedovolením z katalogu Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám)
- G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí G1-checkpoint*
- velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%)
- doubling time mES ~ 12h, hES ~ 24h
- specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16,
nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb)
- inhibice proliferace (suboptimální podmíky) vede k diferenciaci a apoptóse,
diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové
*tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající
itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě
zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky.
Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu
u časných embryonálních buněk
Jak vypadá správná ES buňka?
Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné?
Davey, 2006
Fortunel, 2003
LIF -> STAT3 aktivita u mES buněk
Microarray analýza exprese ,,stemness" genů
pokračování
pokračování
Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk
za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek
růst kolonie ES buněk
Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu
Časného neuroektodermu
Buňky primitivního entodermu
(morphologicky navíc tvoří také malá granula)
30<* 50<* 100<*
*orientační počet buněk v kolonii
epiblastICM
blastocoel blastocoel
trofoectoderm
Myší ES
Lidské ES
vývoj blastocysty
Fortunel, 2003
10
58 685
286
30157
674356
798
1389275
1744337
238
54 267
2
6
23
1
475
332
343
204
637
201
1341 792
Ramalho-Santos
Fortunel
Ivanova
ESC x NPC + RPC/HSC
ESC
ESC + NPCNPC
Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC),
progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši.
Tři pracovní skupiny, jedna metoda.
Gadue 2005
mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu
tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky
primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich
další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002) .
EPL
(+ FGF-5*)
ES
(- FGF-5*)
+LIF
- LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium
*EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk,
které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš)
VYUŽITÍ ES BUNĚK
1. Biologický a biomedicínský výzkum
- Příprava geneticky modifikovaných organismů
- Studium mechanismů časné embryogeneze / diferenciace
- Studium mechanismů kancerogeneze
- Studium embryotoxicity
- Testování farmak
2. Lékařství
- Buněčné a tkáňové terapie
- Příprava biologicky aktivních preparátů
- Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe)
ES buňky v buněčné terapii
Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena
i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo
pluripotentních.
* Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty
* Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk
Příprava geneticky modifikovaných organismů - GMO
- Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou
modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!!
- ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty
do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je
chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.
Příprava KO myší
Diferenciace ES buněk
a) In vivo
- teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně
imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s
farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí
- chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové
blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického
jedince
b) In vitro
- metodiky korespondující s ontogenezí
- metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?)
Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu?
In vitro diferenciace ES buněk
a) Embryoidní tělíska (Embryoid bodies
- EB)
+jednoduché, více buněčných typů
+ tolerující genotyp
- špatně definované podmínky
b) V monovrstvě
+ dobře definovné podmínky
- malá výtěžnost
- silně závislé na genotypu
kultivace
selekceindukce
Rathjen 1998 / Bílek 2004
Loebel, 2003
Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši
Loebel, 2003
Příklady diferenciace myších ES buněk
kombinací typu jejich kultivace
a specifických růstových faktorů
s porovnáním úlohy těchto faktorů
v myší ontogenezi
pokračování
Guasch, 2005
Schuldiner, 2000
Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace
u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek
Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku Rag2-/- mutace
s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování
Rideout, 2002
SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII
- hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu
- dlouhodobá kultivace za suboptimálních podmínek vede k dosud neznámým,
epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i
pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006)
- dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů
- biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře
prozkoumány
- kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech
- etika získávání nových lidských ES linií
- finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté, jestli
současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii
Chromosomální stabilita a ES buňky
Draper, 2004; Hanson, 2005
- dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací
- menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky
na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...)
- u myší snížena schopnost tvorby chimér a zéjména germline u těchto chimér
- často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie)
- nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů
=> adaptace na in vitro podmínky
- hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20
- často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci
této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů
na chromosomu 17 (Survivin ­ proti apoptóse, STAT3 ­ self-renewal mES a nadbytek
u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce))
- na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog)
- časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20
- u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11
(myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17)
Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky
Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007
- u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení
a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu
nebo k indukci apoptósy
- ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC
(SAC ­ splindle assembly checkpoint)
=> akumulace aneuploidních
a polyploidních buněk v populaci
- indukcí diferenciace lze tyto buňky
částečně eliminovat (apoptósa)
- tetraploidní buňky (blastomery)
mohou tvořit jen trofoblast
=> G1 MTA/tetraploidity checkpoint
=> využití při tvorbě embryí plně ES
původu
Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem
ES ­ embryonální kmenové buňky
EB ­ ES diferencovanou formou embryoidních tělísek
Noc/NOC ­ nocodazol
PAC - paclitaxel
Primordiální zárodečné buňky ­ PGC
(primordial germ cell)
- PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu
gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans).
- 6 ­ 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva
embrya do vytvořené zárodečné lišty.
- PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich
zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie
zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc).
- Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale TNAP ne
GCAP/TNAP), Oct4, Nanog, ..
- Významné jsou zdá se zejména Stella a Fragilis.
- PGC nejsou pluripotentní!
- PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti
na imbrední lini
Stella
Také u buněk ES a epiblastu, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu,
po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí.
Fragilis
Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich
migrací jeho exprese klesá.
Cyklus zárodečných buněk u myši
Exprese Fragilis mezi 6 ­ 7 dpc
Exprese Oct-4 v PGC
usazených v zárodečné liště
PGC
primordiální zárodečné buňky
Hayashi, 2007
Mechanismus vzniku PGC
Hayashi, 2007
Embryonální zárodečné buňky ­ EGC
(Embryonic germ cells)
- EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC ­ primordial germ cell).
- Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich
schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo
(chiméry a teratomy).
- Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám
- Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví,
u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje.
Tyto ,,imprinting-free" PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince.
- U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 ­ 12.5 dpc, později to již nelze
- PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších)
- m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF)
(+ feeder & FCS/SR).
- Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné
mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací)
Donovan, 2003
Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty
těchto buněk
Sl ­ Steel locus, Ter ­ Teratoma locus, pgct1 ­ primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN Phosphatase
and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase
mammalian target of rapamycin
Donovan, 2003
Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/
stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk
Není původ ES buněk v PGC ???
Zwaka, 2005
Není původ ES buněk v PGC ???
M- myš; H ­člověk; N/D ­ netestováno; ES ­ embryonální kmenové buňky; EGC ­ časné primordiální
zárodečné buňky (!); LGC ­ pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM ­ vnitřní buněčná masa;
PE ­ primitivní ecdoderm/epiblast
Zwaka, 2005
Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells)
- Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu
- Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk
do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,...), musí být
imunotolerance
- Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových
faktorech (+)
- Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-)
- Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-)
- Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-)
- Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů
- Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+)
Kmenové buňky extraembryonálních tkání
A) Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu)
FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errb
B) Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu)
XEN ­ buňky extraembryonálního entodermu
blastomery
ICM
trofektoderm linie trofoblastu
primitivní entoderm
primitivní ektoderm
zárodečný epiblast / embryoblast
allantois
amnion
mezoderm žloutkového vaku
viscerální entoderm
parietální entoderm
Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu
Neurální lišta a kmenové buňky
neurální lišty
Experiment potvrzujicí pluripotenci buněk neurální lišty