Genetické metody v zoologii Sylabus 1. Analýza fenotypu (signální fenotypy, epigenetické znaky, kvantitativní znaky, analýza landmarků) MM 2. Cytogenetika (analýza karyotypu, proužkování, FISH, „painting“) a elektroforetické metody (proteiny, DNA), DNA-DNA hybridizace MM 3. Analýza DNA I (izolace DNA, genetické markery - jaderná vs. mimojaderná DNA, PCR, real-time PCR, "multi-locus" DNA markery: fingerprinting, RAPD, AFLP) JB 4. Analýza DNA II ("single-locus" DNA markery: mikrosatelity, LINE, SINE, SNP) JB 5. Analýza DNA III (sekvencování - přehled metod, "next generation sequencing") JB 6. Analýza DNA IV (SNP a jejich analýza: RFLP, DGGE, TGEE, SSCP, klonování, microarrays) JB Sylabus 7. Metody analýzy I (populačně-genetická data) - analýzy založené na frekvencích alel v populaci vs. "individual-based" modely JB 8. Metody analýzy II (fylogenetická data) MM 9. Praktické cvičení v laboratoři I (zhotovení chromozomálních preparátů, analýza karyotypu) MM 10. Praktické cvičení v laboratoři II (elektroforéza enzymů) MM 11. Praktické cvičení v laboratoři III (PCR, real-time PCR) JB 12. Praktické cvičení v laboratoři IV (analýza DNA fragmentů po PCR, elektroforéza, fragmentační analýza, SSCP v kapiláře) JB 13. Praktické cvičení v laboratoři V (sekvencování) JB Doporučená literatura (česká) Genetické metody v zoologii Jan Zima, Miloš Macholán, Pavel Munclinger, Jaroslav Piálek Nakladatelství Karolinum 2004 Proč? Proč používat genetické metody v zoologii? n Často nelze jinak n fylogenetické vztahy mezi populacemi a druhy n paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození n identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů n izolace populací – nemusí být zřejmá n počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince Úrovně genetické variability n druh – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika, identifikace druhů) n populace – studium speciace, fylogeografie Úrovně genetické variability n populace – populační biologie, ochranářská genetika) Úrovně genetické variability n jedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genetické markery n kódující DNA (geny) n přepisované sekvence n genetický kód n vytvářejí fenotyp n podléhají přírodnímu výběru n rostoucí význam v přírodních vědách n nekódující DNA n nefunkční (neznámá funkce) n neutrální k přírodnímu výběru n většina DNA u eukaryot (až 95% u obratlovců) n pseudogeny n repetitivní DNA Repetitivní DNA Kódující („funkční“) DNA n studium selekce a funkční variability n třetí pozice kodonů je vysoce redundantní a nepodléhá selekci • ribosomal DNA • nuclear structural (protein coding) genes • mitochondrial DNA 1. Ribosomal DNA 2. Nuclear structural genes n nízká variabilita mezi jedinci – významná funkce, purifikující selekce (nejsou často používány jako genetické markery) – alozymy n MHC geny n SNPs – renewed interest in nuclear structural genes (jednoduché mutace způsobují významnou funkční změnu) n studium transkripce - transkriptomika 3. Mitochondrial DNA „Molekulárně-genetické“ metody n analýza polymorfismu DNA n konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») n sekvenční polymorfismus: „Molekulárně-genetické“ metody n analýza polymorfismu DNA n konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») n sekvenční polymorfismus n délkový polymorfismus Vznik DNA polymorfismu n mutace (transice, transverze, inzerce, delece) n rekombinace (kombinace změn vzniklých mutacemi, duplikace a delece při rekombinačních chybách) n transpozice n Þ obecná molekulární genetika Genotypizace – stanovení genotypu n stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) • izolace celkové DNA z tkání • amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR) • studium variability daného úseku (lokus) Izolace DNA n rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA n dnes většinou komerční kity n velký vliv fixace vzorků n Izolace RNA (exprese specifických genů) – dříve problém, dnes RNAlater Fixace materiálu n čerstvá tkáň n čistý EtOH n rychlé vysušení n speciální extrakční pufry n zamražení n formaldehyd n opakované zamražování n rozvlhčování sušeného materiálu n další fixační média Amplifikace DNA – PCR PCR n Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. n Co se bude množit? To určí primery. n Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle 50 - 65°C) – „annealing“ Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu) Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty („annealing“) Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií Při dalším zahřátí… Inhibice PCR vysokou koncentrací DNA PCR Co když PCR nefunguje? n Měníme teplotu „annealingu“ (nejlépe použijeme gradient teplot, pokud to náš cykler umí) Vyšší teplota=vyšší specificita n Měníme koncentraci Mg^2+ iontů n Navrhneme nové primery Studium variability nasyntetizovaného úseku • délkový polymorfismus n elektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti n Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) n Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) n Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) Studium variability nasyntetizovaného úseku • sekvenční polymorfismus n +/- analýza (elektroforéza) n sekvencování n SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza REAL TIME PCR (= „kvantitativní PCR“) Real-time PCR přístroje Stanovení koncentrace DNA při neinvazivních analýzách Relativní kvantifikace - standardy n Měření úrovně exprese (např. v různých typech tkání nebo treatement vs. non-treatement atd. n housekeeping geny – slouží jako standard pro měření n stejný počet kopií ve všech buňkách n exprimované ve všech buňkách, nezávislé na experimentu