SINE, LINE, etc. (Shedlock et al. 2004, TREE; Ray et al. 2007, MolEcol) • Transposable elements • Vytváří kopie (většinou) • Kopie integrovány na nová místa v genomu • Obvykle nejsou specificky odstraňovány • Molekulární fosílie – neexistují homoplasie !!! • Nesmírně početné • Člověk – víc jak polovina genomu (ost. druhy – 40-90%) Typy transposabilních elementů • Kódující své proteiny, autonomní, 1-10 kb – DNA transposony (cut-and-paste) – transposasa – Retrotransposony (copy-and-paste) – LINE 1-2 proteiny, kopie přes RNA – LTR retrotransposony 5-6 proteinů, také přes RNA • Nekódují proteiny, neautonomní, 100-1000 bp paraziti předešlých, např. SINE (člověk Alu – více než 1 milion kopií) – nejčastěji používané v populačních a fylogenetických studiích LINE – mechanismus transpozice • Kopie přes RNA • Reversní transkriptáza • Mašinerii využívají SINE (jsou to „paraziti“), Alu (SINE) a L1 (LINE) se stejně rychle množí Velmi nízké riziko homoplázií → SINE = ideální fylogenetické markery Neexistují zpětné mutace = výhoda oproti sekvenačním datům Single nucleotide polymorphisms (SNPs) Kolik SNPs se vyskytuje u člověka? • mutační rychlost je ~2.5 x 10^-8 mutací / místo / gen • ~150 mutací/diploidní genom/generace • 6.3 milliard lidí na světě = 945,000,000,000 mutací v současném světě • 3 miliardy nukleotidů = každý nukleotid je zmutovaný 315 krát Příklad informativního SNP znaku Využití SNPs znaků • identifikace druhu (nebo genetické skupiny) - studium hybridizace • fylogeografie • populační genetika (genetická variabilita, identifikace jedinců a vztahů mezi nimi, populační velikost a její změny atd.) Výhody • početné a rozšířené v genomu (v kódujících i nekódujících oblastech) – milióny lokusů • 1 SNP cca každých 300-1000 bp • Mendelovská dědičnost (vs. mtDNA) • evoluce je dobře popsatelná jednoduchým mutačním modelem (vs. microsatellites) • jsou analyzovány kratší fragmenty DNA – neinvazivní genetika Nevýhody • „ascertainment bias“ – výběr znaků se provádí na základě jen malého počtu jedinců a nemusí být reprezentativní • nízká variabilita na lokus (většinou jen 2 alely) • pro populační genetiku je vyžadován větší počet lokusů (4-10 krát více než u mikrosatelitů) Metody analýzy • Nalezení lokusů („ascertainment“) • Genotypizace Nalezení SNPs Sekvenování Sekvencování DNA • Maxam-Gilbertova (chemická) metoda: bázově-specifická chem. modifikace a štěpení fragmentů DNA • Sangerova (enzymatická) metoda: terminace replikace pomocí ddNTP Sequencing Sekvencování DNA Sequencing SNPs genotyping = zjištění genotypu daného jedince SNPs genotyping – sekvenování? Je drahé a nejasné u heterozygotů Heterozygotes? SNPs genotyping – klonování a následné sekvenování? - separation of two (or more in duplicated genes) alleles SNP genotyping - old standards SNPs genotyping – old standards Methods of mutation detection (comparison of specimen’s pattern with pattern of known allelles) • Thermal gradient gel electrophoresis (TGGE) • Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) • Single-strand conformation polymorphism (SSCP) • = special electrophoresis methods based on differences in mobility of different DNA sequences • detekce geneticky podmíněných chorob, např. cystická fibróza Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (TGGE – podobné, ale gradient teploty) Single strand conformation polymorphism (SSCP) Použití automatických sekvenátorů (denaturing polymer POP7 – ssDNA, e.g. microsatellites) Použití automatických sekvenátorů Why not non-denaturing electrophoresis? Advantages of CE-SSCP • high throughput (when using 4, 16, or 96 -capillary sequencer) – time and money saving • no need of gel preparation and autoradiography • distinction of two DNA strains by two colour-labeling (usually FAM and HEX) • potential of multiplexing – not yet used !!! Disadvantages • need for electrophoresis optimisation (running temperature, sieving matrix, dilution of samples) • „complex“ patterns in some sequences Disadvantages • need for electrophoresis optimisation (running temperature, sieving matrix, dilution of samples) • „complex“ patterns in some sequences • alleles with the same pattern may rarely occur • it is necessary to test several run temperatures Data analysis • GeneMapper (Applied Biosystems) • different „Size Standard“ for each temperature • alignement of more samples Applications • Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) Applications • Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) • Identification of number of genes (e.g. duplicated MHC genes) SNP genotyping – old classics SNP genotyping – new methods ASPE: allele-specific primer extension ASPE: allele-specific primer extension (automatizovaná verze) SBE: single base extension Detection or SBE products Microarray detection of SBE products Microarray analysis of SNPs (whole genome approach – „chip technology“) Detekce: Affymetrix, Illumina aj.