CYTOGENETICKÉ METODY

•         analýza mikroskopické struktury chromozomů

•         pojem „chromozom“ - 1888 Wilhelm Waldeyer

•         chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton,
Thomas H. Morgan

•         studium chromozomů: karyologie, cytogenetika

•         karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce



                                       CYTOGENETICKÉ METODY

•         analýza mikroskopické struktury chromozomů

•         pojem „chromozom“ - 1888 Wilhelm Waldeyer

•         chromozomální teorie dědičnosti: 1. pol. 20. stol. - Theodore Boveri, Walter S. Sutton,
Thomas H. Morgan

•         studium chromozomů: karyologie, cytogenetika

•         karyotyp = uspořádaný obraz sady chromozomů v buňce

•         klasifikace typu chromozomů podle polohy centromery:

–    metacentrický, submetacentrický, subtelocentrický, akrocentrický, telocentrický

                                       Historie cytogenetiky

•         role významných technologických inovací - v moderní éře 4-5 takových průlomových momentů:

1      objev hypotonického působení ® rozprostření
metafázních chromozomů

2      kultivace leukocytů periferní krve a fibroblastů

3      metody proužkování chromozomů

4      metody hybridizace in situ (ISH)

5      využití imunochemických metod spolu s ISH ® možnost neradioizotopové detekce hybridizovaných
sond (NISH) pomocí různých fluorochromů („chromosome painting“)



1      výběr tkáně s vysokou mitotickou aktivitou

•         kořenová čepička, embrya, larvy, regenerující tkáně

•         dospělí obratlovci: kostní dřeň, ledviny, slezina, gonády, intersticiální epitelium,
epitelium rohovky

•         někdy stimulace subkutánní, nebo intraperitoneální injekcí fytohemaglutininu, výtažku z
líčidla amerického nebo aktivované suspenze kvasinek



2      zastavení mitotického dělení in vivo, nebo in vitro

•         cytostatikum: kolchicin, kolcemid, vinblastin

•         in vivo: výhoda - levnější, jednodušší

            nevýhoda - nutnost usmrcení organismu

•         in vitro: kultivace periferní krve (krátkodobá) a fibroblastů (dlouhodobá)

             výhoda - možnost synchronizace mitotického dělení ®  snížení variability v kondenzaci
chromozomů, zvýšení kvality preparátu, snížení spotřeby cytostatika





3      hypotonizace buněk

•         destilovaná voda, nebo 0,075 M KCl

4      fixace

•         „Carnoyova směs“ = metanol : kyselina octová (ledová)  3:1

•         několikrát vyměnit

•         pro skvašové preparáty místo metanolu etanol



5      zhotovení preparátu

•         v zásadě 2 základní techniky:

•         skvaš („squash“ = rozmačkání): macerace nebo jemné rozemletí kousků tkáně na podložním
skle a rozmáčknutí silikonovým krycím sklem

•         nakapání („splash“): buněčná suspenze nakapána Pasteurovou pipetou z výšky na podložní
sklo ®  roztáhnutí chromozomů povrchovým napětím;
po nakapání buď vyschnutí na vzduchu („air-dried“), nebo zapálení suspenze („flame-dried“)



                                  Příprava meiotických preparátů

•         testes, pylové matečné buňky

•         hypotonizace citronanem sodným, postup obdobný jako u mitotických preparátů

•         průběh meiózy a význam jednotlivých stadií; synaptonemální komplexy (SC), štětkovité
(lampbrush) chromozomy