Classical & Molecular Cytogenetics - Selected Topics 1. Cytogenetics; mitotic cell cycle; chromosome structure & morphology {v. faba, standard +/- colchicine) 2. Meiosis (cereals: aneuploids, B chromosomes; V. faba) 3. Chromosome mutagenesis (incl. apoptosis in interspecific hybrids and gametocidal effects) 4. Karyotype analysis by chromosomal length differentiation via banding techniques (G, R, C, T, N, AgN03, RE, Q..., mobile NORs, nucleolar dominance) 5. Differential labelling of chromosomes by base analogues (ceil cycle, replication patterns; SCE) 6. Mechanisms Of karyotype evolution (ploidy level; primary & secondary rearrangements; chromosome number alterations, incl. fusion/fission and B-B-F-cycles; too long/too short chromosomes) 7. In situ hybridisation & immunostaining (fish, gish, prins, Painting & applications) 8. Microdissection, flow-sorting & applications 9. Telomeres & Centromeres - prerequisites for eukaryotic chromosomes 10. Heterochromatin & Euchromatin, features and marks 11. Interphase Chromosome Organisation (homologous pairing; sister chromatid cohesion, 'Rabľ orientation - mirror image orientation; meristematic vs. differentiated tissues; evolutionary conservation) Cell cycle, chromosome structure and chromosome morphology Mitotic cell cycle Prophase se ^ßha ABA Aurtin Cytokinin — -Sugar i- 0*Z ! ft? 1» M ^ac^ Aetivalian of ganas required far S prase ůniry weel O ■ívN. T14/VIS T160 >—<«r^ - T/Y prwsphaia&í íCDKA-'B^CAj -CAK V_^^^b^ ^ Auxin GA Cytokinin ____I rSŕŇrJs bj pimih äíik» Flg.1,Modol for fil So: id G2-W1 LritrisiritHii inpfaiUfi UanrdCHirOauUiObiainod in plant*ind on Dpr^lfc-Ls wilh (he mammalian cell-i-Tila »[Urol. During G1. f PMdral flrnvvlh faclnts, f Meh a; JitPfüh, tvlcil« niriraUHĽÍ1iÍĽH(;idlAOAI. ülhMrullmlGA1!, btasaiii^tiir^iriíiOF.rBndiugiirríqiilBlBlhgflxprbiaiůíi of 0-LyjM tvtilrli (CycOl BfflJ (hell Wtan/lk EUlwi nit, cvClin-dnpnndnnt kmasn A ÍCDKAK AoivůCiůfI úí (ha COííA-CvcD cc-mplüK roquiura dissociation ol in* CDK inhibitory pfůiain UtKl, tnu tranac* iption of wnirfi iBlndkicflibylhostHiwcipcinsivntwrmonqABAandpr-uBpricMYtfluooolilii ThrlH) r«iduaof CDKA by IhcCPU 5GtiY3iingkinaíů.CDKD;l,*hicfi ia-upregutatedby GA TneBdbvieCOlíA-CvcPppmpipM initiales ihn pUĎuphofylnlioň id HálpHůblďaicmi [KOlfli n fRR1 dicing l*t* G1 phaj», lhnraby reloaíing [he E2F-Iffwn(tplaK[l^proniolieB.llietrB*™cr^Dnnec*íi^ryforprDBrnss»nir.icS^hu>Ľ A^miroEic ittiVdlüil auxin, cy tpklnín and GA alBO rugulaca tha kinrra activity öl A- a r*d B-typw CCJKa Ijy XtfrJll Ag [hu tnanBCiptipr Of CDKl intfflf A- una B-lypn cyclins. Hi« Ľ2-M Ir-ü-rtitiürt ii «SOCi sirf *iih *i\ HtlvslJng Tlirlŕt) [rvpfrphniy latin n ní CDK by a CDH-ftctiwaiiňfl kinflí* [CAlíl «nd by tteohotp^orylííHon pf 1hf Inhftiwry Ty phn -phnryl.n inn itusi ii induced by eyiükmin. A ubiqumn-dapandflnt dogratjDtion njithmny largnti HlypecyíclinSlůr prOlftSlySiSby lhe anaphase-nromotinn: gotice |APC1 fl-lli« rťiBtipliBSÄ-aľiBphaaeTranBiiloíi, íharaby activating 1ln awil from milou». Cell cycle stages in field bean meristem Metacentric Sub-metacentric Acrocentric satellited Telocentric Chromosomes with centromeres at different positions euchromatin (many gene centromere & kinetochore nucleolus organizer (rDNA repeats) ^ telomere heterochromatin (111 ACjCjCj) (tandem-repetitive sequences) WL spindle apparatus Hierarchie levels of chromosome structure ~200 nun -~600nm- ^ínm ^XJrm i---------1 radiales -------Sthieifennvxiell DMA- Mukleosomen- dicke Doppef- Kette (* důr. ne Chromatin hell* CŕirCmatJnfítaňte] fíbrilte Chromonenra Meta phase -ChrOmoami M D u ii n Microsporogenesis in barley MEIOTIC NUCLEAR DIVISIONS Scheme (7 chromosome pairs) Leptotene Individual chromosomes become visibleas thin structures. Zygotene Homologous chromosomes start pairing from their ends (and centromerese?). Pachytene Chromosome pairing is complete. Recombination between chromatids of homologous chromosomes takes place (crossing over), resulting in exchange of paternal and maternal genes. Diplotene Chromosomes of paired bivalents shorten and begin to separate. Homologues are still connected due to preceeding recombination (chiasmata). D/a/f/nes/s Chromosomes show highest contraction. Chiasmata ,terminalize' 0 # w& !> V w Metaphase I The spindle is developed; bivalents congregate in equatorial plain between the spindle poles. Anaphase I Homologous chromosomes segregate to opposite spindle poles, mediating reduction of chromosome number. The diploid chromosome complement gets haploid. '^Jř 4 Telophase I Homologous chromosomes arrive at the poles. M ŕ ■#> «*»' m i Interkinesis Cohesion of sister chromatids is restricted to centromeres. Metaphase II A new spindle appears. Chromosomes chromosomes arrange in equatorial plate. Anaphase II Sister centromeres separate, chromatids segregate toward the poles. Telophase II Chromosomes arrive at poles and decondense. The nuclear membrane is formed. Pollen tetrade Four pollen cells with haploid chromosome number. Metaphase I in field bean showing six bivalents A minichromosome of field bean (comprising <5% of duplicated genomic sequences) does not segregate properly at meiosis ArabidopsiS thaliana (2n=5; 125 Mbp/C; ~15% repet. DNA) B chromosomes occur in many species in addition to A and sex chromosomes They are: dispensable, generally transcriptionally inactive and display irregular and non-Mendelian modes of inheritance They might have originated as: - As remnant of by-product of interspecific hybridisation - or derived from A and/or sex chromosomes, e.g., as one product of Robertsonian translocation that extends subsequently by sequence amplification and/or reshuffling Brachycome dichromosomatica 2n=4+4B r A Andreas Houben et al., IPK) Nondisjunction of B chromosomes in rye D1100 B-SpecifiC repeat transcriptionally active E3900 B-SpecifiC repeat transcriptionally active (delB) H normal B deleted B Trans-acting controlling region Sticking sites for nondisjunction directed nondisjunction of Bs Jp 4 first pollen mitosis disjunction of delBs vegetative nucleus - generative nucleus - (Carchilan, Delgado, Ribeiro, Costa-Nunes, Caperta, Morais-Cecilio, Jones, Viegas & Houben, Plant Cell, 2007) Chromosome mutagenesis Structural chromosome aberrations (deletions & rearrangements) / t? .# ii M II -? 2/3 within heterochromatin (-10% of the genome) 06-MeG SSB linear dose relationship in all cell cycle stages uniformly distributed and removed (immuno-slot-blot) - linear dose relationship in all cell cycle stages uniformly distributed in eu-/heterochromatin (comet assay) Under adaptive conditions (pre-treatment with MNU 10"4 M, lh): >50% reduction of CA, 06-MeG, SSB Hypothesis: Most (non-DSB) preclastogenic lesions are correctly repaired (dealkylation; excision repair; PRR/SCE) only a minority may lead by coincidence of repair intermediates (SSB) with replication discontinuities to DSBs that cause CA via erroneous recombination between damaged homologous repeats (heterochromatin) Mechanistic interpretation of the origin of isochromatid breaks, intercalary deletions and duplication-deletions via recombinative repair of DNA breaks in tandemly arranged sequence repeats a) intercalary deletion b) duplication-deletion c) isochromatid break ^ HR or NHEJ? Scheme of DNA damage processing during aberration formation treatment with: S-phase dependent clastogens (MNU) I I I Gl G2 I I uniform distribution of potentially clastogenic lesions (06-MeG) arrest in Gi and G2 until completion of correct repair post-replication repair in S-cells yielding ~1 SCE per 40.000 lesions complementation of repair- and replication-mediated gaps to DSB (and/or incompletely ligated SCEs) may result in erroneous recombination (~1 chromatid aberration per 2.5xl07 lesions) preferentially (-70%) between homologous repeats of late replicating heterochromatin blocks, often involving identical sites between homologous chromosomes or chromatids S-phase independent clastogens (bleomycin, ionizing irradiation) I I i Gl G2 I I uniform distribution of clastogenic lesions (SSB, DSB) arrest in Gi and G2 until completion of (mainly correct) repair (predominately via recombination) post-replication repair in S-cells may cause SCEs i I chromosome type aberrations I i chromatid type aberrations, both via non-homologous end-joining or homologous recombination, often between repeats of heterochromatin but less often between identical sites of homologues than after S-phase-dependent mutagen treatment Early chromatin elimination via apoptosis and micronucleus formation of the paternal genome in interspecific hybrids Wheat x pearl millet DAPI TUNEL • 1mi ■* *^lr^H GISH • » merge 9* (Gernand, Rutten, Varshney, Rubtosva Prodanovic, Brüß, Kumlehn, Matzk& Houben, Plant cell, 2005) Two modes of early uniparental genome elimination in interspecific hybrids By spatial separation of parental genomes 1) Mitosis-dependent By imperfect segregation, or parent-specific CENH3 inactivation? p / + heterochromatinization and disintegration of micronuclei + extrusion (.budding') of the apoptotic (paternal) genome A. Houben group: Plant Cell 17:2431 (2005) Chromosoma 116: 275 (2007) CGR114: 169(2006) Karyotype analysis and chromosome length differentiation via banding techniques The first chromosome banding remained unnoticed XF* Chromosoma, Bd. 7, S. 620 62fi (fl956) J Aus dem Biologischen Institut der Keiô-Uníversität zu Yokohama ÜIFFERENT1ELLE FÄRBUNG ÜER SOMATISCHEN METAPHASECHROMO SOMEN VON CYPRIPEDIUM DEBILE* I. Mitteilung Von Noriko Yamasaki Abb. 1. Oi'ccmcssigsänre-Salzsäure-Farbung olme Vorbehandlung. Vergr. 1215mal Abb. 2. Vorbehandlung mit 8-Oxychinolin. Die Pfeile bezeichnen ein an den Qnerstroifen erkennbares homologes Chromosomenpaar. Der Kern ist durch den Druck aui den Objektträger beschädigt worden; einige Chromosomen sind infolgedessen zerbrochen oder ans dem Kern herausgepreßt worden, Vergr. 1215mai Various banding patterns of human chromosome 1 U m G R C Q AO Complementary fluorescence banding on Viciafaba chromosome I CMA-DA DAPI-AD Interstitial and centromeric Giemsa bands in Viciafaba (karyotype ACB) ran 0,44 +0,03 ] nu ii i nmn—n~n oamr Qh43 0n12 0,17 0,62 + 0,03 +0,02+0,03 +0,03 0,35 0,60 +0,02 +0,02 rr~i i i 0,81 0,26 +0,04 +0,02 [-Op 0.30 0.67 +0d05+0,04 16 15 14 4 K 28 27 !A 10 11 12 13 nu ě.gi 19 20 22 21 ■>i 22 26 27j Giemsa- and Pi-banding pattern after Fokl digestion of field bean chromosomes ŕ ran 0,44 +0,03 ] nim i nmn—h~n nifŕin i nmrri i 0,43 0,12 0,17 0,62 +0,03 +0,02+0,03 +0.03 / \ 0,35 0,60 +0.02 +0.02 I 0>81 0,26 +0,04 +0,02 oaoooa I I 0.30 0,67 +0,06+0,04 16 15 14 8 2& 27 n»|lio|ii|i2j FiäIU I a 12 m RŤhalis 14 20 22 21 >i 22 26 27; Giemsa banding of the NOR (N banding) Silver staining of Viciafaba NORs Terminal bridges between silver-stained NORs of onion chromosomes Mobile nucleolus Organisators in Allium A. cepa After loss of satellites 2NORS 4NORS A. cepa x A. fistulosum 4NORS Chromosomes with terminal NORs Intraspecific nucleolar dominance in barley T 6-7 (2 NORs) n Only NOR 6 forms a nucleolus wild-type (2 NORs) Ü (independent of DNA methylation and histone acetylation) (5 12 3 4 5 6 7 67 76 i T 3-6 <] (3 NORs, NOR 36 is inhibited when methylated) D A duplicated NOR forms a nucleolus within the reconstructed field bean karyotype DKP14 aDI H M M 5T 51 kW 1 b i ŕ P -fit „.WKfmm * A ■ V«: ŕ, » J' * \ ' m i 1 . JMI €l |l" '* * Differential labeling of chromosomes by incorporation of the base analogue BrdUrd and fluorescence-plus-Giemsa (FPG) staining BrdUrd-substitution patterns of DNA -without BrdUrd - with BrdUrd A A V V A \A V\ V A A A A I H v A \ v\ \/ A L V A \A y i i A \A 1 V\ V A A V A V A V Chromosome staining X X V Cell cycle stages in BrdUrd G2 Uniformly dark Uniformly dark with grey bands late 5 indicating late replication Uniformly grey with dark asymmetric bands ear|y s [unequal AT between DNA strands; human, mouse, Vicia faba] +dark early replication bands « Uniformly grey [+ asymmetric bands] 5/6 1.S Chromatid differentiation +2.S +"lsostaining" 2 c complete Chromatid differentiation . . « Chromatid differentiation +2 s +"lso-nonstaining" 3xS only % of chromatids In grey Replication patterns after BrdUrd+/- exposure (5 h) & FPG-staining Asymmetrie bands after BrdUrd-incorporation (17 h) and FPG-staining Vida f aba chromosomes: SCEs without and after mutagen exposure •+*+•**** Ks \ f 1 i JpiÄ^ w l/2 of the average spindle axis length may disturb mitosis and organismic development Mitotic/meiotic transmission of artificial chromosomes of different size Species Minichromosome size Mitosis Meiosis DNA content (1C) References Yeast >150 kb <55 kba 100% <100% 100% <100% 10 Mb Murray etal., 1986 Murray and Szostack, 1983 Drosophila 1.3 Mb 0.2 Mbb 100% -87% -50% 0.3-14% 150 Mb Williams et al., 1998 Mouse ~60Mbc ~30Mbd 4.5 Mbe -99% >99% in vitro 30-80% in vivo 10Mb 5-20 Mb 5-10 Mb 100%f 95%f 88-92%s ~99%h 99.8%' >90% 99% 32-38% 31-35%k 3.500 Mb Mills etal., 1999 Ikenoetal., 1998 Harrington etal., 1997 Heller etal., 1996 Kuroiwa et al., 2000 Shinohara etal., 2000 Tomizuka et al., 2000 Voetetal., 2001 Field bean <700Mb 100% n.0%1 66.7%m 13.500 Mb Schubert, 2001 Linear centric plasmid. Neocentric fragment. sat-DNA-based artificial chromosome. Human Y-derived artificial chromosome. Human artificial chromosome with mouse sat-DNA. In hamster cells. In chicken DT40 cells. In human HT 1080 or CHO cells. In chicken DT40, mouse ES cells and chimeric mouse. Up to F3 in mice. F1 in mice. Hemizygous. Homozygous. a b c d e f g h i j k I m Minichromosome of the field bean carrying <5% of the genome as duplication Frequently the minichromosome gets lost during meiosis Field bean karyotype with homozygous minichromosome (2n=14) % i Failure of meiotic pairing leads to loss of minichromosomes in 33% of germ cells Sequence localiation by in situ hybridisation: Fluorescence in situ hybridisation (FISH), Genomic in situ hybridisation (GISH), Primed in situ synthesis (PRINS), Chromosome painting Immunostaining of chromosomal/nulear antigens in situ In situ Hybridisation DNA-Probe IM Markierung und Denaturierung Ziel-DNA Denaturierung UlUUiUUlUUUUUlU Adenin [| Thymin Cytosin Q Guanin f Reporter-Molekül Aldinger '93, Inst für Angewandte Physik 00 In situ hybridisation with radioactive (3HT; 125J) rDNA probes 9} NOP. iWäSätei U ,Vßtf pTňxfflčl 5 i" irr? d,s/a,' iííjfe ■ * 4 9 á * Probe Labels Probe label T Direct fluorophore Fluorescein Z Biotin Binding I Binding 1 Digoxigenin Antibody Avidin or antibody ------1------ Binding Antibody Conjugated to X Fluorophores ± Enzymes blue green red AMCA FITC TRITC Cy2 Cy3 Alexa 488 Texas Red Alexa 594 Counterstain DAPI YOYO PI far red Cy5 Cy7 Fluorescence microscopy Metals " Gold Ferrin Counterstain —H------- i Giemsa Lead citrate Uranyl acetate Transmission light, reflection contrast or transmission electron microscopy I Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase Beta-galactosidase (HRPO or POD) (AP) I Substrate precipitation (GAL) brown DAB1 red AEC* blue NTP/BCIP3 red-brown red blue-purple INT/BCIP" Fast Red5 X-Gar Counterstain I----------'----------1 purple Giemsa blue Hematoxilin Transmission light microscopy (reflection contrast and transmission or scanning electron microscopy) Nick Translation (Rigbyetal. 1977) 1. Nick OH 2. í r* ^^^ 3. ^^^ I-p-p4 f 4- Induction of single strand nicks Enzyme: DNase I Excision of nucleotids at the nick and de novo synthesis using labeled nucleotids Enzyme: DNA Polymerase I Template-DNA markierte Nukleotide unmarkierte Nukleotide Random Priming (Feinberg and Vogelstein 1983) 1. -r- -r- —— nn ■*■ _ -^ 2. J-+ ,. 3. 4- ■*-JL JL JL ^^^ Random primer Template-DNA unlabeled labeled nukleotid nukleotid Denaturation of probe DNA Annealing of random primers Extension of primers by incorporation of labeled nucleotids Enzyme: Klenow fragment DOP-PCR for preferential random amplification of transcribed sequences (Telenius et al. 1992) 5' IccgactcgagI |atgtgg|3 1 Low stringency PCR (Ta = 30°C; 5 cycles) -* frequent priming at multiple sites UZI I ^ 3' ^ I I 3' S 5' ^ v ^ Higher stringency PCR (Ta = 62°C; 35 cycles) . -» specific priming of pre-amplified sequences I I I I ««—1 1 1 1 I I I h-* I I I I 1 í 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 '■■ 1 1 1 1 4955 54 FISH with cDNA containing retroelement sequences on field bean chromosomes FISH with low-copy sequences on field bean chromosomes Field bean chromosomes after Fo&I-digestion or after FISH and PRINS with FoAI-elements (59bp) V.faba Fok/pVÜ (PRINS) 5 S rDNA (PRINS) 45S rDNA/telomeric (PRINS) Vicilin (FISH) barley subtelo-repeat (FISH/PRINS) Sat-DNA (red), rDNA (green) Sat-DNA (red), Copia (green) Sat-DNA (red), En/Spm (gren) matin fib Sat-DNA (red), Copia (green) GISH of barley chromosomes 4HL and 7H in wheat background (Schubert et al. 1998, Plant J. 14:489-495) Painted Indian muntjak chromosomes (F. Yang & M. Ferguson-Smith) Arabidopsis thaliana Chromosome 4 painting Painting of Arabidopsis chromosomes 1 to 5 1 CEN NOR CEN- norQ CEN CEN' CEN CElNS Simultaneous multicolour-painting of all 5 Arabidopsis chromosomes 12 3 4 5 w DEAC ] y biotin-Texas Red * DNP-Cy 5 digoxigenin-Alexa 488 interphase Pachytene mitotic metaphase ^^ diakinesis Two homeologues of chromosome 4 of A. thaliana revealed in Arabidopsis arenosa (2n = 32) NOR I CEN Monoclonal antibodies against plant kinetochores V.faba Barley Immunodetection of kinetochore-specific antigenes across species borders Anti-hCENP C Anti-maize CENPC 48 . [until 1 Anti-hCENP E Anti-hCENP F Field bean chromosomkes after FISH/Immunostaining Barley chromosomes and nuclei after FISH/Immunostaining methylated H3 - Iysine4 (detected at transcriptionally active regions and borders of transcriptionally silenced domains in fission yeast) Arabidopsis Vicia Horde u m methylated H3 - Iysine9 (involved in heterochromatin assembly in fission yeast, Drosophila, mouse) Arabidopsis Vicia Horde u m H3 Ser 10 phos, barley % mH ^ittJL % fr t *, v« r * • £* wl^ ŕ' .V Microdissection of chromosomes and chromosome regions Isolation and flow-sorting of chromosomes and nuclei 1 t** p.. % • ** ■£> ŕ i> 59 iy Je **** rC^ ^ ^ Ä " T**r ^ Synchronized field bean meristem .tí* &* Ä Ä i v £ I $ # ^ ŕ * :^ > r / -£-7, . ■ '£• - H^> # ^ * 20^ m ~ÍP 'i N í« : Microdissected chromosome I V, V 0 %1 lOum * %» lOjim r-1—i rr Laser microdissection of the segment 4 of the C-banded Vic/a faba chromosome 3 karyotype ACB Microdissectins the centric end of a telocentric field bean chromosome & *■-> ht > ■■ 4 ml* 7S G o (C PCR mapping on microdissected translocation chromosomes of barley a. E 4) Horí (C) MWG 800 Physically and genetically integrated map of barley (G Künzel, L Korzun, A Meister, Genetics 2000) 429 markers; 240 TBP; 139 regions — 0.7S 5=0.3 ------■- TB T73ax T74B6 FLof N-band- posltlons Pos. nM Locus -1.2b-«——0.47 ■ T71ai*T72ak T76aab 0.S1 ■ <2.5 ------- -0.3b-»—< T76aaa*T71au>— 0.63 --0.6 -----■- Ui1 ^ TMagtT73al ■>_u'1 -39 Mb» -----•- - 0.6 b -——< T72ac * T73aaa>— 0.79 ■ = 52 Mb" -----»- - 0.4 b -~—£ T73ao * T73aal>— Ď.S4 - -1.0 -----■- -0.2b---< T72aJ+T71ao >- 0.96 -1.8 — Location of S3 TBs;' FL-position ETTSax T74ae T74b j-_J-T71sJ T—^T- T71an/ 0.75 ^j- T75ag ^T-T75ae í 0 75 NOR -"- T7Sab______ -*T- T76aki0.es - L, |-T?2ag í 0.70 -T73aas / 0.64. -T73aam.'' O.fifl -T75ai /DEB -T73a| -T74ab -T74V - T74ae -T73at -T74aa J0.SS J 0.40 I 0.23 í 0.26 .0.23 ! o.ia CĚN T76aab Saf ; o.ss T72ad I 0.84 T76BBB T7Saac/0.07 T74w f 0.14 T7Sad /0.14 T74u /0.17 T73aa /0.19 T78aal IB .23 T78as í 0.26 T78az /C.30 T75ao í 0.31 T72b / 0.31 T74al ,' 0.32 T71ac /0.35 T72af 10.36 T74aj 10.36 T75ap I0.SB T73af /0.37 T7Saa f 0.39 T71ah _j- T72ac _LT73ak /0.79 -T73aae -T7äau 10 93 -T73ao Long arm Chromosome suspension of V.faba FUCHS:EF63 i 20B9\FLIS-AnF LĚ-ÍWa S-Í3 * H I H <3- i 0 i i -*"T-----1—i-----r—i-----f— 50 109 üeT n—■—f—r £00 £50 Flow-sorted chromosomes of the Vicia faba karvotvüe EF Viciafaba karytype ACB after PRINS with Fokl elements c) 200 100 FREQUENCY d) 1000 1000 20O 300 10O0 PI FLUORESCENCE PULSE AREA ■ '--'■ ■ ■ j- .■ ■ 't^' : '. ^ — . ■■■ ■ ,■■■ " )* : ■ #*' 100 BOO 1000 PI FLUORESCENCE PULSE AREA Flow-sorted field bean chromosomes of karyotype ACB Flow-cytometric seed screen to.elucidate the mode(s) of reproduction (FMatzk, A Meister, I Schubert; Plant J 2000) reduced embryo sacs (Polygonum type) unreduced embryo sacs (Hieracium type) á" \ III/ c \ reduced sperm cells In/ c \ endosperm endosperm unreduced sperm cells 2C obligate apomictic Short telomeric repeats stabilise the ends of linear eukarytic chromosomes but lack in Dipteres and in Allium 1) The ,end replication' problem primer 3' 3' Gap 5' Template strand ^ Newly synthesized 5' strand ^ftÉfôngation of 3'-ends by telomerase internal RNA template of telomerase AAUCCCAAU ••• TTAGGGTTAGGqTTA-... AATCCCAA---5 3' 3) Telomere loop formation 3' 5' AATCCC 3' 4) In Allium no TTTAGGG repeats detectable by FISH, Southern, asymmetric PCR or Bal 31 digestion (Pich, Fuchs & Schubert, 1996) ...no telomerase activity in TRAP-assay (Sýkorova et al. ProcRSocLondB, 2003) ...instead recombinative ALT? at 375 bp repeats, rDNA and possibly En/Spm transposons rDNA, Sat-DNA (and transposons?) apparently substitute orginial telomeric sequences at the termini of onion chromosomes Heterochromatin features: •Allocycly •Special staining behaviour •Late replication/underreplication •Low transcriptional activity, few if any genes, position effect variegation' •(Tandem-) repetitive sequences •Deviating base composition •Intense DNA methylation •Specific histone modifications/protein composition (HP1) •No meiotic recombination, frequent mis-repair -> chromosome aberrations •Fast evolution We distinguish: Constitutive, facultative (sex), functional heterochromatin Centromere 760 Kb X3C 94-100 -o -o 22.9 0=0=0 42.5 077 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Corrensstraße 3 06466 Gatersleben Telefon: 03 94 82/5-0 Telefax: 03 94 82/5-139 Email: info@ipk-gatersleben.de Internet: http://www.ipk-gatersleben.de Stand: 1. Januar 2007 Stiftungsrat Vorsitzender: MinDirig Dr. Joachim Welz Stelív. Vorsitzender: MinRat Dr. Jürgen Roemer-Mahler Geschäftsstelle Wissenschaftsorganisation und Öffentlichkeitsarbeit Waltraud Muhlenberg Direktorium Prof. Dr. Ulrich Wobus 1> G esc haftsführend er Direktor Bernd Eise 1> Administrativer Leiter Prof. Dr. Andreas Graner Prof. Dr. Ingo Schubert Prof. Dr. Gotthard Kunze (komm.) _L Wissenschaftlicher Beirat Vorsitzender: Prof. Dr. Eberhard Schafer Genbank-Beirat Vorsitzender: Dr. Reinhard von Broock i \ IPK GATERSLEBEN Personalrat Vorsitzender: Bernhard Claus Abt. Genbank Prof. Dr. Andreas Graner Abt. Cytogenetik und Genomanalyse Prof. Dr. Ingo Schubert Abt. Molekulare Genetik Prof. Dr. Ulrich Wobus Abt. Molekulare Zellbiologie Prof. Dr. Gotthard Kunze (komm.) Abt. Verwaltung und Zentrale Dienste Bernd Eise Charakterisierung & Dokumentation Prof. Dr. Andreas Graner Genomdiversität Prof. Dr. Andreas Graner Genbankdokumentation Dr. Helmut KnUpffer Plant Data Warehouse (BIC-GH-Gruppe) Dr. Ivo Große Bereich: Management & Evaluierung PD Dr. Andreas Borner Arbeitsgruppe: Ressourcengenetik und Reproduktion PD Dr. Andreas Borner In wiro-Erhaltung und Cryo-Lagerung Dr. Joachim Keller Außenstelle „Nord" Dr. Klaus Dehmer Taxonomie* Evolution Dr. Frank Blattner Experimentelle Taxonomie Dr. Frank Blattner Quantitative Evolutionsgenetik Dr. Karl Schmid Taxonomie pflanzengenetischer Ressourcen Dr. Reinhard Fritsch Bereich: Cytogenetik Genomanalyse Prof. Dr. Ingo Schubert Dr. habil. Patrick Schweizer Arbeitsgruppe: Arbeitsgruppe: Karyotypevolution Prof. Dr. Ingo Schubert Chromosomenstruktur/ -funktion Dr. Andreas Houben Apomixis Dr. Timothy F. Sharbel Genomplastizität PD Dr. Renate Schmidt Epigenetik Dr. Michael F. Mette Mustererkennung (BIC-GH-Gruppe) Dr. Udo Seiffert Transkriptomanalyse Dr. habil. Patrick Schweizer Expressions-kartierung Dr. habil. Lothar Altschmied Gen- und Genomkartierung Dr. Marion Roder Bioinformatik Dr. Uwe Scholz Genwirkung Prof. Dr. Ulrich Wobus Genregulation Dr. habil. Helmut Baumlein Phytoantikörper PD Dr. Udo Conrad Netzwerkanalyse (BIC-GH-Gruppe) Dr. Falk Schreiber Arbeitsgruppe: Molekulare Pflanzenphysiologie Dr. Mohammad R. Hajirezaei (komm.) Angewandte Biochemie PD Dr. Hans-Peter Mock Strukturelle Zellbiologie Dr. Michael Melzer Pflanzliche Reproduktionsbiologie Dr. Jochen Kumlehn Hefegenetik Prof. Dr. Gotthard Kunze Arbeitsgruppe: Personalwesen Juliane Becker Finanzwesen Martina Liewald Technologietransfer und Recht Dr. Lankred Schuhmann Materialwirtschaft und allgemeine Dienste Ursula Deppner Technik Willi Bertling Versuchsfeld und Gärtnerei Katrin Menzel Informationstechnologie, Wissenschaftliche Bibliothek und Dokumentation Dr. Matthias Lange in wiro-Differenzierung Prof. Dr. Anna M. Wobus Pflanzengenom-Ressourcen-Centrum (PGRC) Koordinator: Dr. habil. Patrick Schweizer Bioinformatik-Centrum Gatersleben-Halle (BIC-GH) Koordinator: Prof. Dr. Stefan Posch/Universitat Halle Wittenberg 11 Geschäftsführung Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforsphung (IPK) Gatersleben Leibniz-Institut IPK Vorgeschichte des IPK Institut für Ptlanzengenelik und Kulturpflanzenforschung GATERSLEBEN 1943 1945 1946 1948 Gründung des Instituts für Kulturpflanzenforschung der Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften am 1. 4. 1943 in Tuttenhof bei Wien. Ernennung von Hans Stubbe zum Direktor. Januar bis April: Verlagerung der Sammlungen in das Dorf Stecklenberg/ Harz. Oktober: Die Domäne Gatersleben (damals Kreis Quedlinburg) in Sachsen-Anhalt wird für die Ansiedlung des Instituts zur Verfügung gestellt. Angliederung des Instituts an die Universität Halle-Wittenberg unter Beibehaltung seines Namens. Eingliederung in den Kreis der Forschungsinstitute der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin (Nachfolgerin der Preußischen Akademie der Wissenschaften). 1948-64 Aufbau der Institutsgebäude nach einem Generabebauungsplan. 1969 Prof. Dr. Dr. hc. mult. Hans Stubbe gibt die Leitung des Instituts aus Altersgründen ab. Nachfolger wird sein Schüler Prof. Dr. Helmut Böhme. 1969 Umbenennung in „Zentralinstitut für Genetik und Kulturpflanzenforschung." 1969-72 Reform der Institutsstruktur; Bildung von wissenschaftlichen Bereichen und von Querschnittsbereichen. 1983 1989 1990 1991 1992 Prof. Dr. Helmut Böhme übergibt die Leitung an Prof. Dr. Dieter Mettin (früher Universität Halle-Wittenberg). Bildung eines demokratisch gewählten Wissenschaftlichen Rates, der den Rücktritt der Institutsleitung durchsetzt. Berufung von Prof. Dr. Klaus Müntz zum Direktor, der das Institut in einer komplizierten Übergangsphase leitet. Umbenennung des Instituts in „Institut für Genetik und Kulturpflanzenforschung". Schließung des Instituts am 31. des Einigungsvertrages. 12. gemäß Artikel 38 Neugründung als „Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung" gemäß Empfehlung des Wissenschaftsrates. Zum Geschäftsführenden Direktor wird Prof. Dr. Ulrich Wobus und zum Administrativen Leiter Bernd Eise berufen. Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben Entwicklung des IPK Leibniz-Institut T |P|^ Institut für Pflanzengenetik jnd Kulturpflanzenforschuiig G AT ERSLEBtN 1.Januar 1992 Gründung des Instituts für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK). 9. Juni 1993 Festveranstaltung anlässlich der Neugründung des IPK, und wissenschaftliches Symposium anlässlich der Gründung des Vorgängerinstituts vor 50 Jahren am 10. Juni. 29. November bis 1. Dezember 1993 Durchführung der ersten Institutstage; 38 Vorträge und 61 Posterbeiträge vermitteln ein umfassendes Bild von der wissenschaftlichen Arbeit des IPK. Herbst 1993 Berufung und Konstituierung der Stiftungsorgane Stiftungsrat (Vorsitzender Dr. Christoph Helm/Magdeburg) und Wssenschaftlicher Beirat (Vorsitzender Prof. Dr. Diter von Wettstein/Kopenhagen). 13. /14. April 1994 Eine Flutkatastrophe führt zu erheblichen Schäden an und in den Gebäuden des Instituts und zu Verlusten von Forschungsmaterial. Land und Bund ermöglichen mit einer Soforthilfe den schnellen Beginn von kurz- und mittelfristigen Sanierungsarbeiten. 31. Dezember 1995 Dr. habil. Peter Hanelt beendet aus Altersgründen seine Tätigkeit als Leiter der Abteilung Taxonomie. Nach kommissarischer Leitung durch Dr. Reinhard Fritsch übernimmt am 1. März 1996 Prof. Dr. Konrad Bachmann die Leitung der Abteilung. 29. April 1996 Konstituierende Sitzung des Genbank-Beirates (Vorsitzender Prof. Dr. Dr. Gerhard Fischbeck). 6. bis 10. Juni 1996 Erstmalige Durchführung der „Gatersleben Research Conference" zum Thema „Molecular Markers in Plant Genome Analysis and Crop Plant Improvement". 2. September 1996 Erstmalige Verleihung des gemeinsam vom Institut und der Gemeinschaft zur Förderung der Kulturpflanzen- forschung Gatersleben e. V. (gegründet am 1. März 1993) gestifteten Gaterslebener Forschungspreises zur Förderung des wissenschaftlichen Nachwuchses. 1.Januar 1997 Wederberufung von Prof. Dr. Ulrich Wobus als Geschäftsführenden Direktor und Bernd Eise als Administrativen Leiter. Prof. Dr. Konrad Bachmann übernimmt die geschäftsführende Leitung der Genbank. I.April 1997 Beginn des Aufbaus des Pflanzengenom-Ressourcen-Centrums (PGRC); Berufung von Dr. habil. Andreas Graner zum Koordinator. 31. Juli 1997 Altersbedingt gibt Prof. Dr. Klaus Müntz die Leitung der Abteilung Molekulare Zellbiologie an Priv.-Doz. Dr. Gotthard Kunze, der die Abteilung bis zum 15. Januar 1998 kommissarisch leitet. 16.Januar 1998 Prof. Dr. Uwe Sonnewald wird als Leiter der Abteilung Molekulare Zellbiologie berufen. 3./4. März 1998 Erneute Begutachtung des Instituts durch den Wssenschaftsrat. 10. Juli 1998 Veröffentlichung der Stellungnahme des Wssenschaftsrates zur Begutachtung des Instituts. Dem IPK wird eine sehr positive Entwicklung auf sehr hohem wissenschaftlichen Niveau bescheinigt. 24. Juli 1998 Ausgründung der ersten Biotechnologie-Firma - der Firma SunGene - am Standort Gatersleben; später folgen Novoplant (Geschäftsaufnahme 2000) und TraitGenetics (Geschäftsaufnahme 2001). 1.Januar 1999 Die Genbank des Instituts erhält den Abteilungsstatus. Priv.-Doz. Dr. Andreas Börner übernimmt die kommissarische Leitung. 30. April 1999 Grundsteinlegung für den Laborneubau Genomzentrum in Anwesenheit zahlreicher Gäste. 25. Oktober 1999 Beginn einer umfassenden Sanierung der Infrastruktur des IPK. 1. November 1999 Prof. Dr. Andreas Graner übernimmt die Leitung der Abteilung Genbank. 6. September 2000 Zur Verbesserung der Ausbildung der am IPK tätigen Doktoranden wird ein spezielles Weiterbildungsprogramm für Doktoranden begründet. 8. September 2000 Feierliche Eröffnung des IPK-Genomzentrums. 19. März 2001 Beginn der Rekonstruktion des Gebäudes Genetik. 1.Januar 2002 Prof. Dr. Ulrich Wobus wird als Geschäftsführender Direktor und Bernd Eise als Administrativer Leiter wiederberufen. Signal detection Probe hybridized _,—f—,-----___£_ to target after i i I I * I I stringent washes Detection of label . „ .... . Fluorescent label Antibody or avidm (conjugated to {no detection needed) ^k fluorochrome or enzyme) binds to label Fluorescence to microscope Illumination I I I I t I 1 Chromogenic substrate in solution •£ i i i i ' Analysis by Enzyme catalyzed "^ J fJM transmission light preciptitation of microscopy insoluble product PCR - Polymerase chain reaction (Saikaietal. 1985) Double-stranded target DNA 5— 3' Denaturation of ds DNA, annealing of primers Primer 2 Primer 1 Primer extension Complementary 'v Complementary to to primer 2 primer 1 2nd amplification cycle 3' «»www neue Primer S^^^^VWWWN^WV^i« / Products of equal length 3rd cycle Final fragments Cyclic amplification process comprising: i; Denaturation of template-DNA (90-95°C) i) Annealing of sequence-specific primers (40-60°C) iii) Primer extension (70-75°C) Enzyme: Taq-DNA-Polymerase Number of cycles Number of equal-sized amplified ds fragments 1 0 2 1 3 2 4 4 5 8 6 16 7 32 8 64 9 128 10 256 11 512 12 1 024 32 1 073 741 824