Osnova Osnova Saccharomyces cerevisiae Výhody kvasinkového modelu • Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) • Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test =>toxiny v plotnách – HU, MMS …) • Stabilní haploidní i diploidní formy • Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) • Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) • Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní) • Centromerické a multicopy plasmidy • Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) • Lze připravovat deleční a mutantní kmeny • Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“ • Techniky barvení (cytoskelet, stěna ... + GFP in vivo) • S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) • Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) • EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) • Mikročipy - expresní profily za různých podmínek • Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, regulační mechanismy) F. Sherman, Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002): http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/StartedYeast.html Laboratorní kvasinkové kmeny Auxotrofie Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě i 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C) chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), YPD – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa) SD – minimální (syntetické) médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids - aminokyseliny se přidávají dle selekce, 20g/l dextrose (2% glukosa) Transformace – metoda elektroporace - octan litny/PEG metoda Shuttle vektory • Bakteriální část – Amp resistence, Origin • Kvasinková část – marker (+KanMX), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2mm (20 kopii na buňku) začátek replikace • Promotor, tag, MCS – Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce) – Nadprodukce • Suprese mutací (funkční homologie) • toxicita YAC (yeast artificial chromosome) • Bakteriální část – Amp resistence, Ori počátek replikace • Kvasinková část – marker, CEN-ARS, TEL • 50-500kbp insert • Klonování, množení, uchování dlouhých fragmentů DNA • Výzkum savčích telomer a centromer • Použity i v savčích buňkách pro výzkum nesestřihnutých genů (dlouhé regulační úseky) Genetické manipulace - disrupce genu • Studium funkce genu – fenotyp delece či mutace • Nezbytný gen = smrt – plasmid nebo mutanty • Přežívají – křížení tj. hledání funkčně příbuzných genů – Studium funkčních homologií – dvojité mutanty (synthetic lethal x epistatic) Delece genu – PCR Výhody použití URA3 • Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru Cre rekombinasa Delece genu – transposony Testy fenotypu-funkce Životní cyklus S. cerevisiae Tetrádová analýza Příprava mutant Dvojité mutanty – funkční příbuznost Supresory Plasmid shuffling „Transcriptional landscape of the yeast genome“ Analýza ORF-transkribce Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 Buněčný cyklus S. cerevisiae - Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) - Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Buněčný cyklus S. pombe CDC28 a cykliny u S. cerevisiae „Transcriptional landscape of the yeast genome“ Analýza ORF-transkribce