Osnova

Saccharomyces cerevisiae



                                 YAC (yeast artificial chromosome)



        Studium kvasinkových elementů chromosomů definovalo nezbytné části a délku:

       CEN, ARS, TEL

       minimální délka 50kbp

       (až 500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp)

                                     Centromera S. cerevisiae

                                        Centromera S. pombe



                               Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek

•               Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné – barvení DNA na fixovaných
preparátech pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylindole)

•               Použití centromerických proteinů-GFP (green fluorescenc protein) pro studium
dynamiky chromatinu

•               TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně
definovaném lokusu

•               ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence nebo „ChIP on CHIP“

                            DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae



Model separace chromosomů
APC=anaphase promoting complex





                  Kohesin napomáhá při opravě dvou-řetězcových zlomů v G2/M fázi

                                           Poškození DNA
                                 V pondělí 23.11.2009 – J.E.Haber

•              Studium kvasinek po ozáření … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51)

–          Ionizující záření generuje především DSB (double-strand break)

–          UV záření modifikuje nukleotidy tzv. TT-dimery

•              Chemická činidla/mutageny modifikuji nukleotidy – mají za následek změnu genetické
informace

–          MMS (methyl methan sulfonat) – (např. MMS21)

–          Alkylační činidla (např. EMS = ethyl methan sulfonat), ROS (reactive oxygen species)

•              HU (hydroxy urea) blokuje replikaci – v mutantách dochází ke kolapsům replikační
vidlice (např. HUS1) => DSB





                                        Opravné mechanismy

•              Dvoj-řetězcové zlomy (DSB)

–          homologní rekombinace (HR) – v přítomnosti homologů (tj. sesterské chromatidy v G2 fázi)

–          nehomologní spojování konců (NHEJ) – v G1 fázi

•              Jednořetězcové zlomy, modifikace nukleotidů

–          Přímé opravy (specifické enzymy)

–          Vystřihování poškozeného úseku (BER, NER – excision repair)

•              Opravy chybného párování

–          MMR – mismatch repair (MSH1-6, MLH1-3)

–          Speciální polymerázy (TLS – translesion synthesis)

                                            Oprava DSB