EVROPSKÁ UNIE k^ ^^ ^řr 4T MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost IMI INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR 1. Teorie PCR Organizace Přednášky 14.12. 13:00 15.12. 16.12. 17.12 13:00 13:00 8:00 Úvod do PCR Kvantifikační strategie a anlýza dat / r Instrumentace, fluorescenční barviva a sondy Design sond a primem, aplikace, troubleshooting Cvičení - 3 identické seminární skupiny - přihlašování prostřednictvím ISu; 4.1.-7.1.2010 11.1.-14.1.2010 21.1.-24.1.2010 Kontakt: PetrVaňhara pvanhara@gmail.com Sabina Ševčíková sevcik@med.muni.cz Zdeněk Ručka rucka@sci.muni.cz ř 5 49 49 77 80 ILBITA3 Literatura A Z of Quantitative PCR Mr-fa ■ http://www.gene-quantification.info/ Google • Bustin SA: A-Z of quantitative PCR. lUL Biotechnology Series, Vol. 5, La Jolla, California, 2004-2006 edHed by Stephen A AUSTIN • Dorak T: Real Time PCR. BIOS Advanced Methods, Taylor & Francis Group, NY, 2007 • Stephenson FH. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory. Academic Press 2003. atd. Molekulární technologie 1952 Elektroforéza 1967 • Rekombinantní DNA • Objev DNA ligázy 1969 FISH 1970 • Reštrikční endonukleázy • Reverzní transkriptáza 1972 Klonování 1973 In vitro konstrukce bakteriálního plazmidu 1975 Southern blot 1977 Sekvenování DNA 1980 Koncept RFLP 1981 Western blotting 1982 • Manipulace s genomem Drosophily - P elementy • Whole genome shotgun 1984 Pulzní gelová elektroforéza 1985 •PCR • DNAfingertyping 1987 •YACs • Místně cílená mutageneze 1988 Taq Polymeráza ChlP 1990 BLAST 1992 BACs 1995 Microarrays 1998 RNAi 2002 UCSC Genome Browser 2003 DNA assembly programs 2004 Anotace genů - ENSEMBL 2005 • Projekt HapMap • Ligační sekvenování 2006 Celogenomové metylační mapy 2007 miRNA 2009 Next Generation Sequencing What about DNA? Maurice Wilkins-James Watson-Francis Crick-Rosalin Franklin, 1953 Nobelova cena Wilkins-Watson-Crick,1962 model dsDNA King's College London Molekulární technologie Jakým způsobem bez použití PCR: 1. zjistíte, zda pacient nese nějakou, klinicky významnou, bodovou mutaci, která např. určuje jeho další léčbu? 2. zjistíte, který ze dvou genů je v nějaké tkáni (např. nádorové) exprimován více než druhý ? 3. stanovíte druh patogenní bakterie ve vzorcích z nemocného pacienta? 4. zastoupení leukemických buněk v krvi pacienta před a po léčbě? South Northi FI owe Kultivace, hiDchamické analýzy tw£||mi Cytogenetické vyšetření Koncept cyklické reparativní replikace 1971 Studies on polynucleotides XCVL. Repair Replication of Short Sythetic DNA's as catalysed by DNA polymerases. Kjell Kleppe Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana H. G. (1971): J.Mol.Biol.56,341-361. N V ^ X * * O - DNA polymeráza Denaturace X Re natu race Har Gobind Khorana & Replikace ®L Nová DNA polymeráza Denaturace Renaturace Replikace Práce popsala některé parametry reparativní replikace - účinnost replikace, minimální délky primem a templatu, sekundární struktury atd. Proč se nerozšířila tato metoda už v 70.letech? Extrémně nákladná syntéza oligonukleotidu, nedokonalé sekvenování, termolabilita a nákladná purifikace DNA polymeráz... První možnost diagnostické replikace DNA 1985 Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. i science ■*- Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Eriich HA, Arnheim N. Science. 1985 Dec 20;230(4732): 1350-4. Two new methods i n i > i r i m I in i I ihh h 11 11 > I < I lliil liiulily 'ini'iilim mm n il il ITagnostic test for sickle cell anemia. The first involves the primer-mediated enzymaTH amplification of specific beta-globin target sequences in genomic DNA, resulting in the nrpnnrrrnTThtnrTrrnnn (220^000 times) of target DNA copies. In Tn.f ^p^fh lecnnique, the presence of the beta A and beta S alleles is determined by restriction endonuclease digestion of an end-labeled oligonucleotide probe hybridized in solution to the amplified beta-globin sequences. The beta-globin genotype can be determined in less than 1 day on samples containing significantly less than 1 microgram of genomic DNA. Praktická aplikace PCR 1987-8 Kary B. Mullis Nobelova cena za chemii 1993 Použití termostabilní DNA polymerázy Rozvedení konceptu navrženého K. Kleppem Obrovský boom PCR díky technologickému pokroku • 363 629 článku k 27.11.2008 •399 022 k 1.12.2009 399 919 k 14.12.2009 PCR Cyklické střídání fází denaturace, annealingu a extenze jednoduchou změnou teploty reakční směsi Polymeráza využívá syntetické primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA A. Double stranded DNA B. Heat to separate strands 1 96° I 1 C. Cool and allow primers to anneal .......... 50° D. Copy complementary sequence using a DNA polymerase 72< j i Forward primer Baclward primer _ Parental strands Melt Anneal Extend _J First cycle Second cycle Third cycle PCR Exponenciální proces Amplikon, templát Amplifikace (y) = N x 2n N= počet molekul templátu, n počet cyklů PCR Otázka: 1 Jedna molekula DNA je amplifikována v 25 cyklech. Teoreticky, kolik molekul amplikonu (y) je vytvořeno? 2.Počáteční množství molekul templátu je N=600. Kolik molekul amplikonu je vytvořeno? 3.Reakce je provedena v IOOjliI. Kolik molekul amplikonu bude přítomno v 1 nl (0,001 jal)? ' (1, ') (( . 1) I I I I Odpověď: 1. 225=33 554 432 2. 600x225=2x1010 3. 2x1010ve100(il -* v 0,001 jíl bude 2 x 105 (200 000) molekul amplikonu KONTAMINACE JE PROBLEM Jediná molekula DNA může způsobit velké problémy (forenzní genetika, rutinní screening a diagnostika, GMO...) PCR Otázka: 2 ng lidké genomové DNA byly použity jako templát pro PCR. Výsledkem je 100 ng DNA o délce 242bp. Jaká je míra amplifikace? Odpověď: 1. Určení počtu kopií obsažených v daném množství DNA (2 ng genomové DNA; předpokládáme haploidní genom) N haploidní genom 3 x 109 -> m = ~Ňa~ ^w průměrná MW báze: 660 g/mol r , 3 109_______1_ mipgj- 6,023 1023 1012 množství DNA obsahující jednu kopii: rn [pg] = 3,3 pg počet kopií ve 2ng DNA: cca 600 (606) PCR 2. Určení hmotnosti 242bp. fragmentu hmotnost (m) 242bp fragmentu: r , 242x 660 1 m[Pg]" 6,023 1023 1012 m[pg]= 2,7x10"7pg počet kopií ve 100ng amplifikované DNA: 100 ng x 103 r , 0 _ Hn11 . n=---------------------- m [pg] = 3,7 x 1011 kopu 2,7 x 10"7pg 3. Určení míry amplifikace 3,7 x 1011 y= -------------------- =6,2 x 108 600 Bylo dosaženo 6,2 x 108 nárůstu množství amplikonu Kinetika PCR reakce Theoretical / DNA y=N 2n jr\Plateau fáze Target Exponenciální fáze^ Actual o >^ y=N(1+E)n Cycle no Kvantifikace pomocí PCR Conventional Konvenční vs. Real-Time PCR rt-pcr Real-time RT-PCR transcription M R*v« m transcription v cD HA transfer to PCR ŕMdJoň ŕ? £T cDNAmnafar to PCR rucüon iß T r PCR »action ff j* 1? J + Transfer forwated PCR ruction r T Gel •léCtKphOFMl* T i DNA sequencing Southern Mol 1 &cnsilOF«ioiľyí p h os phoi m ag i n g jy j ^ 1 if Manual or automated PCR reaction Quantitatfva analytic _______._____S* nodi Kvantifikace pomocí PCR „End point" Konvenční kvantitativní PCR -„End point" stanovení • Kvalitativní odpověď YES/NO • Extenzivní validace, kontroly • Denzitometrie • Minimální rozptyl v parametrech reakce má obrovský vliv na množství amplikonu ^ 145 bp ^ 115 bp w\/w..... 1000 300 100 30 ID G16 GS G4 G2 Gl m * 4i 185 bp ^ USbp \s n/ n/ n/ v \y \y \ | 1_______2 3 1 5 .. 1 2 3 Patient 1 Patient 2 4" iss bp 4ü n £ bp I S/\/N/ VN^N/X/ 3 * AjlA Patient 2 • Interní heterologní kontrola (housekeeping gene) • Syntetický standard • Kompetetivní PCR • Viral load u HIV+ pacientů • Výskyt minimální reziduálni choroby u onkologických pacientů Palienl 3 mnnoo o, 10000 1D00 COPY NUMBER CELL NUMBER X 1/1Q0OO Kvantifikace pomocí PCR „End point" Zásadní omezení - gelová elektroforéza • Nízká přesnost • Nízká citlivost • Malý dynamický rozsah - pouze 2log. • Nízké rozlišení, založené pouze na délce amplikonu • Není automatizovaná • Výstup není numerický - subjektivní hodnocení • EtBr - neváže se na DNA pravidelně • Post PCR zpracování - kontaminace Alternativy detekce amplikonu Průtoková cytometrie Clinical Ciiemislry 46:8 1057-1064 (2000) Molecular Diagnostics and Genetics Flow Cytometric Analysis of Reverse Transcription-PCR Products: Quantification of p2lWAFI/CiPI and Proliferating Cell Nuclear Antigen mRNA Niels Wedemeyer," Wolfgang Göhde, and Thomas Pötter „End-point" biotiifyfated primer RT product digoxlgenin-labeled primer rfiqim"iTir; T'T B^ PCR reaction; isolation of PCR product after different cycles Primer removal using silica magnetic particles -Mo Intermeciiate smollflcation product Binding and staining of PCR products streplavidin-R-priycoerythrin Anti-digaxigenin magnetic pr: - ■:' ■ s Washing Measurement of fluorescence intensity by ffow cytometry Fluorescence intensity Alternativy detekce amplikonu „End-point" Chemiluminiscence PCR ■» DNA Denaturace a hybridizace se specifickou sondou Chemiluminiscence Intenzita chemiluminiscenčního signálu v závislosti na množství amplifikované DNA PCR Biotinylované primery > Biotinylovaný amplikon Streptavidin + magnetické částice Separace chemiluminiscence aVWv Alternativy detekce amplikonu „End-point" Fluorescence correlation spectroscopy Proc. Naíi Acod. Sei. USA Vol. 93, pp. 12805-12810ľ November lW6 Biochemistry Fluorescence correlation analysis of probe diffusion simplifies quantitative pathogen detection by PCR i am pi irication/A/vfvfracier iuw /pri mť r extension/ lei ramel h>| r h i irla mi ne/1 itratlon) NilsG. Walter*. Petra Schwille. and Manfred Eigen t De-partmenL of litochemKal Kinetics Mai Placet Institute for lito-physiĽal Chemistry, Am Fassberz. D-ÍT077 fitkttngen, Germany Cofitribuled 6y Manfred Ligen. August 26. Í996 PRI PCR PCR i ^ Sample cell Excitation monochromator Xe lamp emission monochrom a tor1 Photo detector Real - time detekce amplifikace Real-time Fluorescence Based PCR & Reverse Transcription PCR Kvantitativní vztah mezi Množstvím PCR produktu (amplikonu) a intenzitou fluorescence • Účinnost PCR musí být u všech vzorků stejná • Amplifikační práh (Ct) musí ležet v exponenciální fázi (lineární část křivky) „end point" Cycle no Real - time detekce amplifikace Real-time Fluorescence Based PCR Fluorescence R je zajištěna např. vazbou fluorescenčního interkalačního barviva na DNA, použitím hydrolyzační sondy atd. Fluorescence reportérového fluoroforu může být normalizována vůči pasivnímu fluoroforu (Rox) - Rn. Změnu fluorescence v čase vůči pozadí udává ARn. (ARn=Rn+-Rn). l-Oe+001 i—i-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1—i 1.Ce-Ü05 '—'----'----'----'----1----'----'----'----'----1----1----'----'----'----'----'----1----'----'----'----'----'----1----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----'----L 1 2 3 4 5 6 7 8 3 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Real - time detekce amplifikace - Ct Treshold cycle „Cf - určený na základě hodnoty fluorescence pozadí - kvantitativní výstup pro každý vzorek Real - time detekce amplifikace - Ct Treshold cycle „Cf - počáteční množství kopií templátu - definovaný v exponenciální fázi PCR - stejná účinnost PCR ve všech reakcích - účinnost štěpení fluorogenní sondy nebo vazby fluoroforu na DNA - citlivost detekce - čím menší Ct tím větší počet kopií templátu na začátku reakce A> B > C Real - time detekce amplifikace - Ct Treshold cycle „Cf - rozdíl 1 Ct - dvojnásobné množství templátu 21 = 2 - kolika cyklům odpovídá odpovídá 10ti násobný rozdíl v množství templátu? (předpokládáme 100% účinnost PCR) 2n= 10 n=log10/log2 = 3,32 c [ng/|il] Ct 50 28,16 100 27,16 150 26,66 250 26,06 300 25,66 Přestávka 7 i / HoC N N CH3 N. CH3 O (Kofein) Faktory ovlivňující qPCR Faktory ovlivňující qPCR Koncentrace Mgll+ (Mnll+) - Kritický faktor pro DNA polymerázy - Napr. Tth (Thermus thermophilus HB-8) Mnll+ (3-6mM) Taq (Thermus aquaticus) Mgll+ (3-4mM) - Některé polymerázy preferují určitou formu Mgll+, mimo MgCI2 napr. MgS04 nebo Mg(OAc)2 Koncentrace primem -obvykle 100-900nM - ne vždy poskytuje ekvimolární koncentrace nejlepší výsledek Koncentrace sondy -obvykle 100-400nM - volba sondy podle typu analýzy a žádaného výstupu (genová exprese, SNP, absolutní kvantifikace...) Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy -Vyžadují 3'OH primer - Teplotní stabilita - nejvyšší katalytická účinnost mezi ľO-SCTC - Výrazná ztráta aktivity při nižších teplotách • např. Taq při 37^ má pouze 10% své normální aktivity - Fidelity, maximální amplifikovatélná délka amplikonu - bakteriální Jaq Thermus aquaticus - nízká fidelity -absence 3' > 5' exonukleázové aktivity (proofreading) -Archeální enzymy - Thermococcus sp. (T. gorgonarius, litolaris, kodakaraensis) • Tgo, Vent, Pfx - Pyrococcus sp. (R furiosus) • Pfu, Deep Vent http://www.biologie.uni-regensburg.de/Mikrobio/Thomm/Buttons/bilder/thermococcus-ch-Pt.jpg Faktory ovlivňující qPCR DNA polymerázy a PCR Jméno 3'>5' Exoaktivita Zdroj Poznámka Taq - Thermus aquaticus Poločas rozpadu v 95 5' exonukleázové aktivity zvyšuje specif itu reakce - Některé aplikace (TaqMan) vyžadují 5' > 3' exonukleázovou aktivitu polymerázy (odbourání sondy, in vivo RNA primem při syntéze Okazakiho fragmentů), jiné aplikace (molekulární majáky, scorpions) naopak vyžaduj í polymerázy bez nukleázové aktivity Genová exprese, RT-PCR RT PCR Reverse Transcription PCR - dvě na sebe navazující enzymatické reakce Reverzní transkripce PCR mRNA cDNA V mRNA CDNA AAAMi * • AAAAAAAAAAAAAA—AA TTTTTTTTTTTTT RNase H degrades template, ■ i .si-.;: Iriiütii- ::■! "J .1 IDA AAAAAA ~" I--V- AAAAAAAAAAAAAA -AA llll III II — TTTTTTTTTTTTT Reduction ol RNase H promotes li ig der yields Of fuli-lemjl'i C DNA Parental strands Melt Forwsrd primer Bacrward primer Anneal First cycle Extend ___J Second cycle Third cycle - mnohonásobně citlivější než napr. northern/dot blot, RNAse /S1 protection assays, nebo ISH - exprese mRNA, detekce a kvantifikace virů atd. http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32 http://www.obgynacademy.com/basicsciences/fetology/genetics/images/pcr.png Kvantitativní RT PCR „two step" RT-PCR RNA "• Reverzní transkripce cDNA ' PCR 'Í /í? tE""E"—ľfľn" 0,1 lí tí i 0 10 20 30 40 Cycle „one step" RT-PCR RNA \ Reverzní transkripce cDNA & PCR o: J> *>? ~~*- f i -■- (i ' li\í ř - h III I 20 30 40 Cycle Kvantitativní RT PCR „Cells to Cť approach 3' m RNA b' RT prirmer £■ cDNA Cell Lysis 1. Remdvů culture media. Wash cells with PBS. 2. i Optional) Dilute DNasei into Lysis Solution 3 Add Lysis Solution and mix 5 timas Incubate for S min at room temp I19-25*C) Add Stop Solution and mix. 5 times Incubate for Z mín ntom temp Reverse Transcription (RT) 1. Assambla an RT magrer mix and aliquot into reaction tubes/plates 2. Add lysáte (up to 45%) and mi k thoroughly 3. Run the RT thetmal cycle Real Time PCR 1. Assemble a PCR cocktail and aliquot into reaction tubes/platen 2.AddcDNA(upto45%) and mix thoroughly 2. Run the PCRs in a real-time PCR instrument Figune 1, Samples are Ready for RT-PCR in Just 7 Minutes. The TaqMan® Gane Eiptassion Calte-ta-CT™ Kit requiras only 7 minutes at room temperature to release nucleic acide into a cal lysáte solution. He centri rugatian is needed, and (he solution is compatible with RT and real-time PCR (optional DNata treatment included). One or two step PCR One step nebo two step PCR? One tube/two enzymes Two tubes/two enzymes Feature Advantages Disadvantages Feature Advantages Disadvantages Reduced hands-on time Fewer errors More rapid Higher throughput Dedicated enzymes Separate optimisation enhanced sensitivity More pipetting errors Less pipetitng Fewer errors Multiple priming options Separate cDNA pool Multiple targets Reagents added at start Less contamination No separate optimization cDNA synthesis Safer long term storage Higher temperature Higher specifity Target specific priming only RT Reverzní transkripce - templát polyribonukleotidy i polydeoxyribonukleotidy - syntéza DNA na základě RNA templátu - tzv. RDDP nebo DDDP aktivita (RNA/DNA directed DNA polymerase) - replikace retrovirů (HIV) Průběh RT 1. RDDP syntéza DNAŕetézce podle RNA templátu 2. odbourání RNA, RNAse H 3. DDDP syntéza druhého DNA řetězce RT Reverzní transkripce Primery - endogenní náhodný priming - nežádoucí variabilita v PCR - náhodné primery (hexamerv, oktamery, dekamery) - převažující frakce cDNA- rRNA, problematická determinace low copy targets - nadhodnocuje množství mRNAvuči specifickým primerum - oliqo dT TTTTTTTTTTTTTTTTTTT - polyAmRNA NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAA - histony nebo virové geny postrádají poly A - nutná RNA o vysoké kvalitě (nefragmentovaná) - „anchored oligo dT" - specifické primery N TTTTTTTTTTTTTTTTTTT - nejvhodnější pro kvantifikaci NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAA - separátní reakce pro jednotlivé stanovované sekvence RT Reverzní transkripce Reverzní transkriptáza • vysoké procento chyb (nemají proofreading) • citlivost k sekundárním strukturám - způsobí terminaci polymerace nebo vynechání úseku sekundární struktury • vysoká procesivita v případě malých amplikonů - krátké molekuly cDNA • optimální reakční teplota öO-öö'C • dvojmocné ionty, Mnll+' Mg - fidelity .Jf-a 0**e c o- i= A A 3CC ŮtCULG^CCauc^^UAŮCmCíT ft "c ooŕ Qc6Lf cc a* iŕ Gc AoatíiooC c c c íiQ* Na hill h&Mbah iiitioitc aiií^jtÔQ tiiiii ioiiii éiiiiii Ä MalukuKriuni Mnhiwn íiRPKNA, íSKMHB.MiiK-li 10,2000) RT Reverzní transkripce Aditiva • optimalizace účinnosti RT • ovlivňují termostabilitu enzymu nebo tvorbu sekundárních struktur templátu • různé výsledky s různými enzymy a reakčními podmínkami Trehalóza 0,6M/15% glycerol - brání tepelné inaktivaci enzymu Zvyšuje enzymatickou aktivitu MMLV-RT při 60*0 Úspěšná syntéza řetězců o délce 10kb Zvýšení specifity odT primem (Superscript II) OH HO' -O. A. HO^ VS) V "OH OH H L., Betain (trimethylglycerin) Osmoprotektant Stabilizace AT párů Snížení termostability GC párů - snížení Trn Kombinace 2M betainu a 0,6M trehalózy Závislost na templázu a amplikonu Optimalizace v* o o RNáza H Reverzní transkripce RNáza H degradace duplexu cDNA/RNA KompetUje se Syntetickou aktivitou RT (Degradace duplexu DNA primer/RNA proběhne s větší pravděpodobností než extenze řetězce) = snížený výtěžek cDNA Ale: Zároveň je klíčová pro PCR - neodbouraná RNA omezuje hybridizaci primem a snižuje citlivost PCR - tvrdé denaturační podmínky (97^) http://www.ambion.eom/techlib/tn/101/1.html AMVRT Reverzní transkripce AMV (Avian myeloblastosis virus) RT Syntéza DNA z DNA nebo RNAtemplátu DNA primery, oktamery a delší jsou efektivnější než hexamery Nekompetetivně inhibovaná tRNA Optimální reakční teplota 42*0 Modulární enzym Thermoscript (Invitrogen) - vyšší teplotní stabilita (65*0), redu kovaná aktivita RNázy H (tvorba cDNA knihoven) Četnost chyb 4,9 x 104 AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRUS ÍAMV) LTR [ZZr- gag ůpol 672 689 MG v-fnyb gcaggc MTTCT GA.............G CTATC AT acígaa i.iibin.......i.....miririi iitrnfitlrHlitr LT=} 5372 7121 Perbal B., Retrovirology 2008, 5:49 MMLV RT Reverzní transkripce MMLV (Moloney murine leukemia virus) RT • Nižší aktivita RNázy H než v případě AMV-RT • Termolabilní, optimum 37°C • DNA i RNA primery, DNA primery 9-15bp vhodnější • Modulární enzym • Modifikované MMLV RT (redukce aktivity Rnázy H, termostabilita) - Superscript II (Invitrogen), Powerscript (Clontech) • Mgll+ - syntéza dlouhých cDNA • MessageSensor (Ambion) - One step PCR, pro kvantifikace už od 500 fg RNA - RNAse H + 4w b $ DNA pol RT Reverzní transkripce DNA polymerázy s RT aktivitou Tth (Thermus thermophilus), Tfl (T flavus), BcaBEST (Bacillus caldotenax) -Takara RDDP i DDDP aktivita Vyšší termostabilita než RT Vysoká četnost chyb (nemají 3' - 5' exonukleázovou aktivitu) C. therm polymerase (Roche) Klenowuv fragment z Carboxydothermus hydrogenoformus Vysoká teplotní stabilita a přesnost syntézy (četnost chyb poloviční ve srovnání s Tth) Ostatní RT Reverzní transkripce Omniscript, Sensiscript RT (Qiagen) Nejsou odvozeny od AMV RT nebo MMLV RT Obtížně transkribovatelné templáty O OmniMľqrt RT Fiil Lenglh cDNA Product M 37 12 SO "C JL O MMLV RNase H" RT ľmiealeil c DNA Products or .>- h- ™ .^ cDNAí with Internal Deletions m 6i t\jĹ oU L- 10< 103 1CF 10 copies - 330 bp 1000 £00 2S0 12S E2 31 ng RNA OmnííCľípt (QIAGEN) MMLV RNase H" (SupplĚT L) MMLV Supplier L] AMV RNase H" ÍSnpplkcf L] AMV (Supplier P) 500 50 10 1 0 cells p-Aclin NF-JťB Inositol receptor Dyslropliin 210bp 4G0bp 240 bp 3G0bp Sensiscript RT http://www1. qiagen. com/Products/Pcr/QiagenReverseTranscriptases/OmniScriptRT.aspx?Showlnfo=1 Kontaminace Kontaminace v PCR Cross contamination Carry-over contamination Vzorek 1 Vzorek 2 Vzájemná kontaminace vzorků Přenos amplikonu do dalších PCR PCR1 PCR 2 PCR1 PCR 2 Kontaminace Jak předejít kontaminaci • Správná laboratorní praxe • Plastik v „RNA/PCR" kvalitě • Automatizace X m UBI'" ,;ü-':: Piston Unprotected air space: Aerosol contamination Filter-------->■ „, Aerosol---------*&' H Tip- 1..I. Gilsori Pipetmarv® P200 Regular air Microman® positive Gilson Microman® M50 displacement displacement pipette pipette Figure 11 Two pipetting concepts; air displacement using standard filter tips, and positive displacement as applied in the Microman pipette. www.millipore.com; www.appliedbiosystems.com Application note: Contamination-pipetting: relative efficiency of filter tips compared to Microman® positive displacement pipette. Nature Methods 3 June 2006 Hot Start HotStart Taq • Modifikace polymerázy (Chemická modifikace, MoAb) • Upravená, teplotně senzitivní polymeráza Nucleic Acids Research, 200i. Vol .11. No. 21 6139-6147 DOI: 10.1O93/nar/gkg813 Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR Milko B. Kermekchiev, Anatoly Tzekov and Wayne M. Barnes* DNA Polymerase Technology Inc., 1508 South Grand Avenue, St Louis, MO 63104, USA and Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 660 South Euclid Avenue, St Louis, MO 63110, USA Add TaqStatt Antibody with your 7aq-derived DNA Polymerase during PCR set-up Polymerase activity blocked Begin thermal cycling Polymerase activity restored .<* oř *^ ^ > .V* > vi- .0 P *Ä? ja* jy jdv.jv. ;sA íP M ^\0> ^ tjýí cj£ tý& \0r-\C M www.qiagen.com Hot Start HotStart dNTPs • Modifikace termolabilní tetrahydrofuranovou (THF) skupinou (cyklický ether) • Brání extenzi a dimerizaci primerů • Zvýšením teploty dojde k uvolnění THF a vzniku standardních dNTPs Fig 1: Proposed activation mechanism of CleanAmp™ dNTPs dNTP—-"X OOO um i r n n n HO-P-O-P-O-P-O^ „ B Standard s"""-?/ OH OH OH V S primer /Enzyme"; PPi )—' 5' -------------*"▼ dN'TP o Target 95 °C SO V- i «4 x<4 95°C OOO dNTP HO-P-O-P-O-P-C v°s OH OH OH Standard Jb, \ \__/ _ PPi :, P"mer /Enzymes........... dNTp o^ 3' H Target JE = thermolabile THF protecting group 1.0 B - Chsairtmp. lOOng Standard, 100ng CleariArop. 10 ng Standard 10 ng — Jlean^mp 1 ng Standard, 1 ng OwnfjBp, 0.1 ng Standard U.lng — CleanAmp. 0.01 ng - Standard, 0.G1 ng —CleanAmp. NTC - Standard, NPC 0.0O1 0.01 0.1 1 1Ü 100 1000 Human genomic DNA {ng) Figure 2. Comparison between standard dNTPs and CleanAmp™ dNTPs for amplification of a 187 bp target from human genomic DNA in quantitative PCR. Results are presented as an amplification plot {A) and a standard curve (B) with standard dNTPs: (Y = -3.19ľLOGÍX) + 33.36, Eff. = 105.8%) and CleanAmp™ dNTPs (Y = -3.079*LQG(X) + 32.12, Eff. = 111.2%). 187 bp 235 bp 384 bp 638 bp S = Standard dNTPs C = CleanAmp™ dNTPs Figure 1. Comparison of (A) standard dNTPs and (B) CleanAmp™ dNTPs for amplification of a 235 bp target from human genomic DNA over a range of annealing temperatures. (C) Performance of standard and CleanAmp™ dNTPs for the amplification of four targets from human genomic DNA. Hot Start Alternativní HotStart přístupy Fyzické oddělení jednotlivých reakčních složek Vyvázání nebo chemická modifikace primem © 1993 Oxford University Preis Nucleic Acid! Research, 1993, Vol. 21, No. 12 2959-2960 An alternative hot start technique for PCR in small volumes using beads of wax-embedded reaction components dried in trehalose S.Kaijalainen, P.J.Karhunen,,i, K.Lalu1 and K.Lindström Fig. 1. USB HotStart-IT Method: Primer Sequestration PCR Reaction Preparation without Hot Start IIIIIIIIIIIIIIIIIII * rr n"i....."mm % Pvlymcra» primers with itn-carnpltnvenlary region minimum 1 © primers hybrfdiz» lo each other at lov,' temperatures polymerases are recruited !o hybrid I IIMIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII'fll IIIIIIIIIIIIIIII.IIIII.III.IIIIIIIIUI,., ■ primer-dlmera ere produced ■ PCR Failure PCR Reaction Preparation with USB Hot Start Method IhlllilUIIIIIIIII^ ■'«*»» ™"»™ ;r >v rriTITTTTTl rnTTTlTTI r % lllllllllllllllll -* y ^niiniifiiiiriiiiiii^ s'i 11 j.......: 11111 iTrmiTiľ! ......- ••............................... Palyŕi'/Cfiit • primers wlUi «elf-complementary region * tin d in a protein* Inltfnel with primers * denaluratlon slep Inacüualea binding prolalns ' primers fit jequpstered el low temperatures * primers bind to specific targets ■ prevents non-specific hybrldiiaflon and BilonsFon ■ PCR Sum&St UNG Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) • odstraňuje uracil z DNA • zahajuje bazovou excizní reparaci - dochází k odštěpení poškozené báze (deaminovaný cytosin) a vzniku AP místa (apurinové, apyrimidinové místo) DNA containing U formed by deamination of C /v v \N A W V í AP cndonuclease M |W| V\ V ^ A W V Deoxyribosephosphodiesterase 1 FS V/\AW Vi V^/ AA/( V :3E DNA polymerase Ligase W^/VWVt^AWV E AP Site 7HF CELL, Fourth Edition, Figure 6.21 © £006 ASM Press and Sinauer Associates, Inc. UNG Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) Pokud reakční PCR směs obsahuje dUTP místo dTTP, výsledný amplikon bude obsahovat „U" místo „T" UNG rozpozná místa v DNA,která obsahují „U" a štěpí je za vzniku AP místa DNA obsahující AP místa je termolabilní Lze tak zabránit „carry over" kontaminaci - PCR produkt nemůže být reamplifikovaný 1 1 1 o 1 1 i o 1 1 i o 1 1 -o-p=o 1 —o-p=o —o-p=o 1 1 O— CH2 1 O— CH2 o_ 2H2 K? tf bA o 1 -o—p=o 1 —o—p=o 1 —o-p=o 1 1 o—c 3H.2 UNG 1 o—c 3H.2 HEAT o— 2H2 o /ohlnC=o V o Alkaline PH v 1 — o- p=o 1 —o-p=o — o O—GHs O— CH2 1 —o-P=0 1 —o o 1 -p=o 1 — O kf o 1 - p=o 1 O— CH2 o O----------- O 1 —o-p=o 1 o-------- UNG Uracil-DNA-glykosidáza (UNG) Použitím UNG a vhodné směsi dNTP, lze zabránit „carry over" kontaminacím v laboratoři - PCR produkt nemůže být reamplifikovaný • Vlastnosti DNA obsahující „U" místo „T": - dU mají stejnou schopnost hybridizace jako dT - lze ji použít i pro dideoxy-NTP sekvenování PCR fragment lze přímo klonovat do UNG" kmenů I First-Srand CDNA synthesis 1 TTTTT .AAAAA Trest with RNase H Single-stranded cDNA 1 Proceed to real-Ěme quantitative PCR r Thermal Cycler Protocol - Thermal Profile | Auto Increment | Ramp Rate | Stane J_______ Stane 2_______ Stane 3_______ Reps: 1 j 50.0 2:00 1 Reps: Reps: 40 95.0 10:00 95.0 0:15 60.0 1:00 www.appliedbiosystems.com; www.invitrogen.com Konec Shrnutí Po dnešní přednášce: • umíte si popsat kinetiku PCR • znáte rozdíl mezi end-point a real-time PCR • víte, co to je R, Rn, ARn, Ct • rozumíte vztahu mezi Ct a množstvím amplikonu • umíte popsat a rozhodnout se, kdy použít One Step a Two Step PCR • víte, co to jsou DNA polymerázy a reverzní transkriptázy, znáte jejich charakteristiku i průběh reverzní transkripce • víte, co to znamená HotStart PCR a UNG a jak předejít případným kontaminacím ^^^^^^^ ^T^^ I MINISTERSTVO ŠKO EVROPSKÁ UNIE W^ ^0 I mládeže a tělovýc <í £T?!