Bi9310 ­ Úvod do kvantitativní PCR
QRT-PCR ­ ANALÝZA EXPRESE A VLIV INHIBITORŮ NA PRŮBĚH PCR
Skupina mRNA ­ U937/U937 TPA
Cíl: rozdíl v expresi cycD1 v buňkách ošetřených TPA vs. neošetřené buňky
qPCR :
cDNA do reakce 50ng
Triplikáty + NTC, NoRT kontroly
Složení PCR jako v případě kalibračních křivek.
Skupina mRNA ­ zdravá mozková tkáň vs. nádorová tkáň
Cíl: rozdíl v expresi cycD1 v buňkách zdravé mozkové tkáně vs. nádorové tkáň
cDNA do reakce ­ upřesnění podle výsledků kalibračních křivek (složení PCR reakce
shodné)
Triplikáty + NTC
Skupina SYBR green - inhibitory
Cíl: Charakterizovat účinek EtOH, SDS a na průběh a efektivitu qPCR
Složení PCR shodné jako v případě optimalizace primerů - koncentrace primerů určena podle
výsledků optimalizace
Kalibrační křivky: Sériové ředění
Ředicí varianty: naředit tak, aby nanášený objem byl 2l (s výjimkou 25ng)
25 ng (2,5l)
10 ng
1 ng
100pg
10pg
1pg
Na destičku připravit čtyři varianty kalibračních řad
1. kontrolní ­ bez ovlivnění
2. 1% EtOH (zásobní 100%)
3. 0,005% SDS (zásobní 10%)
4. 5% DMSO (zásobní 100%)