Hilf    ^r     O®
^^^^^^^™   .    — ^ľ^  I       MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ,          OP Vzdělávání             ^^rfJ^sS
EVROPSKÁ UNIE    •^ ^B^   ■          MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY        pro konkurenceschopnost           M1VAP
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY
BÍ9310 - Úvod do kvantitativní PCR
QRT-PCR - IZOLACE RNA A REVERZNÍ TRANSKRIPCE
IZOLACE CELKOVÉ RNA (Sigma-Aldrich, Mammalian Total RNA Miniprep Kit, RTN-70)
1. Centrifugovat buňky (1500 rpm/5 min.)
2. Odstranit médium a promýt buňky 1 x PBS
3. Centrifugovat buňky (1500 rpm/5 min.)
4. Odstranit PBS
5.  Lyžovat buňky přidáním 500(il Lysis Soltion/2-ME
6.  Nanést lyzát na filtrační kolonku (modré kolonky)
7. Cfg. 12000 rpm/2 min
8.  Přidat k filtrátu 500|il 70% EtOH
9.  Nanést po 700(il na izolační kolonku (bílá s červeným pruhem)
10.  Cfg. 12000 rpm/15 sec. Filtrát odstranit
11.  Nanést na kolonku 500(il Wash Solution 1
12.  Cfg. 12000 rpm/15 sec. Filtrát odstranit
13.  Přenést kolonku do čisté mikrozkumavky
14.  Nanést na kolonku 500(il Wash Solution 2
15.  Cfg. 12000 rpm/15 sec. Filtrát odstranit
16.  Nanést na kolonku 500(il Wash Solution 2
17.  Cfg. 12000 rpm/2 min. Filtrát odstranit
18.  Cfg. 12000 rpm/1 min.
19.  Přenést kolonku do čisté mikrozkumavky a eluovat RNA 50(il Elution Solution
IZOLACE mRNA (Roche, mRNA Isolation Kit)
1.  Centrifugovat buňky (1500 rpm/5 min.)
2.  Odstranit médium a promýt buňky 1 x PBS
3.  Centrifugovat buňky (1500 rpm/5 min.)
4.  Odstranit PBS
5.  Lyžovat buňky přidáním 400(il Lysis Buffer
6.  Homogenizovat injekční jehlou
7.  I mobilizovat 300 (il SM P a promýt 500 (il Lysis Buffer (odstranit Storage Buffer)
8.  I mobilizovat SMP a Lysis Buffer odstranit
9.  K lyzátu přidat 3 (il biotinylovaných odT a resuspendovat v takto připravené hybridizační směsi promyté SMP
10.  Inkubovat kompletní hybridizační směs 5 min/37<C
11.  Imobilizovat SMP (cca 3 min)
12.  Promýt SMP 500|il Wash Buffer
13.  Imobilizovat SMP
14.  Promýt SMP 500|il Wash Buffer
15.  Imobilizovat SMP
16.  Promýt SMP 500|il Wash Buffer
17.  Imobilizovat SMP
18.  Pečlivě odstranit Wash Buffer
19.  Přidat 50|il Redist. Water
20.  Inkubovat 2 min/65^C
21.  Separovat SMP a odebrat supernatant
Stanovit c [nq/iill, A260/A280, A260/A230, vyhodnotit celé absorpční spektrum
Hilf    ^r     O®
^^^^^^^™   .    — ^ľ^  I       MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ,          OP Vzdělávání             ^^rfJ^sS
EVROPSKÁ UNIE    •^ ^B^   ■          MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY        pro konkurenceschopnost           M1VAP
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY
REVERZNÍ TRANSKRIPCE (Roche, Transcriptor RT)
1.  1(ig celkové RNA nebo 250ng mRNA s 2(il RH nebo 1(il odT v celkovém objemu 13(il inkubovat 10 min/ öö'C. Po skon cení inkubace okamžitě přenést na led.
2.  Reakci doplnit podle tabulky
3.  Inkubovat 30 min/oo'C. V p řípadě RH předřadit annealingový krok 10 min^ö'C
4.  Inkubovat 5 min/85^C
5. Archivovat -25<C nebo mén ě
Tab. Reakční směs RT
Denaturovaná směs RNA + primerů	13^1
RT Buffer	4liI
RNAse inhibitor	0,5^1
dNTPs	2liI
Transcriptor RT	0,5^1
Celkem	20^1