QRT-PCR ­ KALIBRAČNÍ KŘIVKY
1. Sériově naředit cDNA ­ 10X; do reakce 2l, 6 datových bodů
mRNA (12,5ng/l):
jednotlivé reakce budou obsahovat:
25ng (bez ředění), 2,5ng, 0,25ng, 25pg, 2,5 pg, 0,25 pg
celková RNA (50ng/ul):
jednotlivé reakce budou obsahovat:
100ng (bez ředění), 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1 pg)
2. Připravit mastermix pro požadovaný počet reakcí (viz tab. 1)
Tab. 1. Složení reakce s Taq-Man sondami
Objem [l]
1x 25x
2x TQ Gene Expression Master Mix 12,5 312,5
20x TQ Gene Expression Assay (cycD1­ FAM) 1,25 31,25
20x TQ Endogenous Control (GAPDH ­ VIC) 1,25 31,25
cDNA 2 PCR
voda 8 200
3. Do každé jamky na 96 jamkové destičce pipetovat 23l takto připraveného mastermixu
(triplikáty)
4. Do každé jamky nepipetovat 2l cDNA odpovídajícího ředění
5. Do jamek sloužících jako No Template Control napipetovat 2l PCR vody.
6. Provést qRT-PCR, po skončení běhu stanovit Treshold a jednotlivé Cts
7. Vypočítat účinnost PCR z grafu log. ředění vs. Ct
QRT-PCR ­ OPTIMALIZACE KONCENTRACE PRIMERŮ PRO ANALÝZU POMOCÍ SYBR GREEN
Cílem je otestovat, která z kombinací koncentrací primerů bude nejvhodnější (nízké Ct, absence
nespecifické amplifikace)
Postup:
1. Zředit zásobní roztok primerů (GAPDH, 100M) na výslednou koncentraci 5M a 2,5M*
2. Podle tabulky připravit a rozpipetovat 96 jamkovou destičku
Objem [l]
2x Power SYBR Green Master Mix 12,5
Reverse primer různá 50-900nM
Forward primer různá 50-900nM
cDNA 25ng
PCR voda různá
Wells 2x Power
SYBR Green
Master Mix
5M (2,5M *)
Forward
Primer
5M (2,5M *)
Reverse
Primer
Templát PCR voda Finální
objem
A1­A2 12,5 0,5* 0,5* 2,5 9,0 25
A3­A4 12,5 0,5* 1,5 2,5 8,0 25
A5­A6 12,5 0,5* 4,5 2,5 5,0 25
B1­B2 12,5 1,5 0,5* 2,5 8,0 25
B3­B4 12,5 1,5 1,5 2,5 7,0 25
B5­B6 12,5 1,5 4,5 2,5 4,0 25
C1­C2 12,5 4,5 0,5* 2,5 5,0 25
C3­C4 12,5 4,5 1,5 2,5 4,0 25
C5­C6 12,5 4,5 4,5 2,5 2.0 25
D1­D2 12,5 0,5* 0,5* 0 11,5 25
D3­D4 12,5 0,5* 1,5 0 10,5 25
D5­D6 12,5 0,5* 4,5 0 7,5 25
E1­E2 12,5 1,5 0,5* 0 10,5 25
E3­E4 12,5 1,5 1,5 0 9,5 25
E5­E6 12,5 1,5 4,5 0 6,5 25
F1­F2 12,5 4,5 0,5* 0 7,55 25
F3­F4 12,5 4,5 1,5 0 6,5 25
F5­F6 12,5 4,5 4,5 0 3,5 25