Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR


                                        Izolace celkové RNA


RNeasy Mini kit (qiagen)


Přidat β-merkaptoetanol: 10 μl na 1 ml RLT pufru


 1. Každý vzorek rozsuspendovat v 1200 μl RLT pufru, vortexovat
 2. v případě buffy coatu nechat 1 hodinu stát při RT, vortexovat
 3. Každý vzorek cfg přes 1 QIA Shradder
 4. centrifugace 2 min/ max rychlost (14.5000 rpm)
 5. Přidat 1 objem  70 % EtOH k supernatantu, promíchat pipetou
 6. Pipetovat po 600 μl na Minispin kolonky
  + Centrifugace 15s/11.000 rpm, supernatant odstranit
 7. Na stejnou Minispin kolonku napipetovat podruhé 600 ul
  + Centrifugace 15s/11.000 rpm, supernatant odstranit
 8. Přidat  700 μl RW1 pufru na kolonku
  + centrifugace 15s / 11000 rpm, slít supernatant
 9. Přidat 500 μl RPE pufru na kolonku, rychle převrátit
  + centrifugace 15s / 11000 rpm, slít supernatant
10. Přidat 500 μl RPE pufru na kolonku, rychle převrátit
  + centrifugace 2 min / 11000 rpm, slít supernatant
11. Centrifugace 1 min na max rychlost
12. Kolonky umístit do nové 1,5 ml epinky, přidat 40 μl RNase free vody ke vzorkům
  + Nechat stát cca 5 min
  + ctg 1 min / 11000 rpm
13. Změřit koncentraci RNA a čistotu na nanodropu


Měření množství RNA a čistoty na Nanodropu:

Nutné změřit koncentraci, a absorbanci a tzv. Ratio při 260 /280 a 260/230. Obě hodnoty musí být
nad 1,5. Jinak je nutné RNA precipitovat.

















                                 Reverzní transkripce RNA do cDNA


 1. Připravit výchozí množství vzorku tak, aby množství RNA bylo 100ng, doplnit vodou do 10 ul
 2. Připravit Mastermix – 10 μl, podle přiloženého návodu

      High Capacity cDNA Reverse Transctiption Kit (Applied Biosystems)


Složka

                                                                                                             Množství (μl)

                                           10X RT Buffer

                                                                                                                  2,0

                                       25X dNTP Mix (100mM)

                                                                                                                  0,8

                                       10X RT Random Primers

                                                                                                                  2,0

                                 MultiScribe Reverse Transcriptase

                                                                                                                  1,0

                                        Nuclease-free H[2]O

                                                                                                                  4,2

                                               Total

                                                                                                                 10,0


 3. Přidat 10 ul připravených vzorků s RNA
 4. udelat no RT kontrolu (žádná reverzní transkriptáza, místo toho voda) a 4 tubicky normalni RT
reakce
 5. Reverzní transkripce – dle návodu



                                              Krok 1

                                              Krok 2

                                              Krok 3

                                              Krok 4

                                              Teplota

                                               25 ˚C

                                               37 ˚C

                                               85 ˚C

                                               4 ˚C

                                                Čas

                                              10 min

                                              120 min

                                               5 min

                                             neomezeně