Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR

                                       18. - 21. ledna 2010


                                    QRT-PCR – KALIBRAČNÍ KŘIVKY



1. Sériově naředit cDNA – 10X; do reakce 2ml, 6 datových bodů


celková RNA (50ng/ml):

jednotlivé reakce budou obsahovat:

100ng (bez ředění), 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1 pg)


2. Připravit mastermix pro požadovaný počet reakcí (viz tab. 1)


Tab. 1. Složení reakce s Taq-Man sondami



                                                                                                 Objem [ml]


                                                     1x

                                                                                                         25x

2x TQ Gene Expression Master Mix

                                                                                                    12,5

                                                                                                        312,5

20x TQ Gene Expression Assay (cycD1–FAM nebo JUN-FAM)

                                                                                                    1,25

                                                                                                        31,25

TQ Endogenous Control (GAPDH–VIC)

                                                                                                    1,25

                                                                                                        31,25

cDNA

                                                                                                      2

                                                                                                          -

PCR voda

                                                                                                      8

                                                                                                         200



3. Do každé jamky na 96 jamkové destičce pipetovat 23ml takto připraveného mastermixu

(triplikáty)


4. Do každé jamky nepipetovat 2ml cDNA odpovídajícího ředění


5. Do jedné jamky sloužící jako No Template Control napipetovat 2ml vzorku NO RNA (po zpětné
transkripci bez RNA), do jedné jamky sloužící jako No RT Control napipetovat 2ml vzorku NO RT (po
zpětné transkripci bez reverzní transkriptázy).


6. Provést qRT-PCR, po skončení běhu stanovit Treshold a jednotlivé Cts


7. Vypočítat účinnost PCR z grafu log. ředění vs. Ct







                            QRT-PCR – OPTIMALIZACE KONCENTRACE PRIMERŮ

                                   PRO ANALÝZU POMOCÍ SYBR GREEN


Cílem je otestovat, která z kombinací koncentrací primerů bude nejvhodnější (nízké Ct, absence
nespecifické amplifikace)



Postup:


1. Zředit zásobní roztok primerů (GAPDH, 100mM) na výslednou koncentraci 5mM
a 2,5mM*


2. Podle tabulky připravit a rozpipetovat 96 jamkovou destičku (hodnoty v tabulce jsou v ml)





                                Bi9310 – Úvod do kvantitativní PCR

                                       18. - 21. ledna 2010


                                               Den 2


Skupiny 1 a 3 budou pipetovat do jedné společné destičky. Skupina 2 bude mít k dispozici vlastní
destičku.



Skupina 1:


Stanovení kalibrační křivky, výpočet účinnosti PCR.


Optimalizace s TaqMan sondou detekující cyklin D1 (cycD1) bude provedena na buňkách U937
neovlivněných TPA.


pozn.: TPA = 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, označovaný také jako PMA
(phorbol-12-myristate-13-acetate)



Skupina 2:


Stanovení optimální koncentrace primerů GAPDH, denaturační křivky.


Využití SYBR Green.



Skupina 3:


Stanovení kalibrační křivky, výpočet účinnosti PCR.


Optimalizace s TaqMan sondou detekující onkogen JUN bude provedena na buňkách RPMI senzitivní na
Velcade.