ÚVOD DO KVANTITATIVNÍÚVOD DO KVANTITATIVNÍ
REAL-TIME PCR
2. Kvantifikační strategie
Repeatability (Opakovatelnost)
Intra-assay variabilita (stejná analýza v jedné laboratoři)
Kvantifikační strategie
Přesná kvantifikace závisí na:
Reproducibilty (Reproducibilta)
Inter-assay variabilita (stejná analýza v různých laboratořích)
Accuracy (Správnost)
Precision (Přesnost)
Shoda mezi experimenty (,,jak přesně pipetujeme")
Shoda mezi experimentálně zjištěnou hodnotou a realitou
Kvantifikační strategie Faktory ovlivňující PCR
Templát ­ Izolace RNA
- Volba zdroje (charakter tkáně, biopsie, mikrodisekce...)
- Integrita (RNA Integrity Number ­ RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA- Integrita (RNA Integrity Number ­ RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA
- Čistota (A266/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů
- Přesné určení koncentrace RNA
- Celková RNA nebo mRNA?
- Vhodnost metody, automatizace, výtěžek...
Reverzní transkripce
- Významný zdroj variability v qRT-PCR
- Metoda izolace RNA může významně ovlivnit proces reverzní transkripce
Kvantifikační strategie
- Metoda izolace RNA může významně ovlivnit proces reverzní transkripce
- Volba primerů, enzymu, teplotního profilu
- One step vs. Two step PCR
- Výtěžek cDNA
- sekvence směrem 5'konci signifikantně nižší výtěžek než 3'- sekvence směrem 5'konci signifikantně nižší výtěžek než 3'
- RNáza H
Kvantifikační strategie
End-point vs. Real-Time PCR
­ Vztah mezi vstupním množstvím templátu a výsledným množstvím amplikonu je úměrný pouze
v exponenciální fázi rakce.
­ Klasická PCR proto musí být zastavena ještě před dosažením plateau fáze.
­ Intra-assay variabilita klasické PCR (30-40%); Inter-assay variabilita (50-70%)­ Intra-assay variabilita klasické PCR (30-40%); Inter-assay variabilita (50-70%)
Plateau
end point
Plateau
fáze
Exponenciální amplifikace
pod úrovní pozadí -
background
Exponenciální lieární
fáze
real-time
Kvantifikační strategie
Zpracování dat A data přímo z přístroje
B vyhlazení dat
C normalizace pozadí (na základě nespecifické fluorescence)
D normalizace amplitudy signálu (na základě plateau)
Množství polymerázy
Koncentrace primerů
stanovení Ct
Tvar mikrozkumavek
100%
Kvantifikační strategie
Účinnost PCR (Efficiency)
Y=N 2n
Y=N (1+E%)n
Účinnost PCR je 100% jen výjimečně, dokonce i v
případě opakovaných PCR identických templátů
Účinnost PCR
Kvantifikační strategie
Externí standardy
Kvantifikační strategie
NC = N0´(E + 1)C
N0 = NC/(E + 1)C
N0 = Nt/(E + 1)Ct
Směrnice (k) = -Log(E + 1)
E = 10-1/k
Posun = Log(Nt)
Nt = 10posunNt = 10posun
Platné za předpokladu:
E je konstantní během celé PCR
E standardů a vzorků je shodná
Gen 1
Gen 2
Výpočet účinnosti PCR ­ externí standardy
Kvantifikační strategie
GAPDH
Gen 3
k E %
Gen 1 -3,3848 1,9744 97,44
Gen 2 -3,8847 1,8089 80,89
Gen 3 -3,560 1,9094 90,94
Reference gene
(GAPDH)
-3,4594 1,9475 94,75
Ideálně -3,32 2 100
R2  0,98
Kvantifikační strategie
Výpočet účinnosti PCR ­ externí standardy
1. E = 10-1/k
- obvykle od E = 1,60 ­ 2,10 při R2 > 0,989
- pg ­ desítky ng cDNA
- vztah mezi Ct a log množství cDNA ­ lineární ­ min. 5 řádů- vztah mezi Ct a log množství cDNA ­ lineární ­ min. 5 řádů
- nadhodnocování reálné účinnosti PCR
2. Výpočet z nárůstu fluorescence v lineární fázi
- E = 1,35 ­ 1,65
- podhodnocování reálné účinnosti (datové body z oblasti blízké plateau)
3. Výpočet na základě všech datových bodů (Sigmoidal curve fitting method, SCF)
- Není nutné odečítání hodnot pozadí
- E = 1,35 ­ 1,65
4. Výpočet na základě nárůstu fluorescence v exponenciální fázi
- Yn = Y0(E)n
Účinnost PCR
Kvantifikační strategie
Otázka:
Provádíte PCR alikvotu templátové DNA obsahujícího 3×105 kopií. V předchozích
experimentech jste určili efektivitu reakce 85%. Kolik cyklů musíte provést, abyste
dosáhli výsledného počtu kopií 2 ×1010 ?dosáhli výsledného počtu kopií 2 10 ?
n
Odpověď:
Y= N(1+E)n
Y = 2 ×1010
N = 3×105
E = 0,85
n = ?
2 ×1010 = 3×105 (1+0,85)
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)n ×
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)
0,67 ×104log
n ×
K amplifikaci z 3××××105 na 2 ××××1010 s účinností 85% je nutných 18 cyklů.
n =
0,67 ×104log
log 1,85
n = 17,8
Absolutní kvantifikace Relativní kvantifikace
Kvantifikační strategie
1. Absolutní kvantifikace
* srovnání Ct jednotlivých vzorků s externím standardem (kalibrační křivkou)
* Exaktní výsledek ­ zvolená jednotka (např. počet kopií/ng RNA/ml krve/
Kvantifikační strategie
genom/buňku/hmotnost tkáně... atd.)
* Vysoká reprodukovatelnost, specifita a přesnost kalibračních křivek
* Velký dynamický rozsah ­ 101-1010 molekul templátu
* Validace
* Volba externího standardu (recDNA, gDNA, RT-PCR produkt, recRNA, syntetické
oligonukleotidy...)oligonukleotidy...)
* Reprodukovatelnost výsledků
Externí standardy Výsledek absolutní kvantifikace závisí na
1.Volbě standardu
2.Good laboboratory practice
Kvantifikační strategie
DNA
- Plazmidová DNA, genomová DNA, cDNA, syntetické oligonukleotidy
- Velmi stabilní, odolné vůči náhodnému štěpení
- Úseky DNA cca 2kb mají podobné vlastnosti jako mRNA/cDNA
- Reprodukovatelné výsledky
- Snadné stanovení koncetrace
- Kalibrační křivky založené na DNA nereflektují RT krok
- Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
Externí standardy
Kvantifikační strategie
RNA
* RecRNA (rekombinantní RNA)
­ syntetizována přímo nebo in vitro z plazmidové DNA, obsahující klonovaný RTPCR
fragment
* Reverzní transkripce
- Odlišná kinetika reakce jako u nativní RNA
- Neodráží zastoupení jednotlivých RNA frakcí (rRNA 80%, tRNA 10-15% a další)
* Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorůˇ Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
* Stabilita a citlivost k nukleázám
* Komerčně dodávaná celková RNA nebo její frakce (polyA, tRNA) jako tzv.
background RNA ­ zvýšení účinnosti RT RecRNA
Externí standardy
Kvantifikační strategie
Externí standardy
Kvantifikační strategie
Je nutné vytvářet pokaždé novou kalibrační křivku? Jaká je její reproducibilita?
Předpokládáme stejnou instrumentaci, reagencie i templát (opakujeme stejnou kalibrační křivku)Předpokládáme stejnou instrumentaci, reagencie i templát (opakujeme stejnou kalibrační křivku)
variabilitia
2-3% směrnice (k)
10% posun (q)
y= k x + q

- Některé přístroje (např. Roche Lightcycler) umožňují ukládání standardních křivek a jejich
kalibraci (korekce q) prostřednictvím jediného datového budu v každé analýze (za předpokladu
konzistentního designu analýzy)
Kvantifikační strategie
Efekt počátečního počtu kopií
Odhady množství templátu nad 1000 kopií jsou relativně přesné (chyba 1%)
Ale - malý vstupní počet templátových molekul ­ chyba narůstá
Např. účinnost PCR 80%  v každém cyklu pravděpodobnost 20%, že nedojde keNapř. účinnost PCR 80%  v každém cyklu pravděpodobnost 20%, že nedojde ke
zdvojnásobení počtu molekul
Monte Carlo effect
závisí na množství templátu ­ čím je menší množství
templátu, tím je i menší pravděpodobnost, že množství
amplikonu bude odrážet skutečné množství templátu (nárůstamplikonu bude odrážet skutečné množství templátu (nárůst
variability)
Monte Carlo effect
100ng 10ng 1ng 0,1ng 0,01ng 0,001ng
Přesto, lze úspěšně kvantifikovat i extrémně malá
množství templátu:
Stanovení 10 kopií genomu viru hepatitidy C v plazmě
Intra-assay variabilita (CV) 3,1%
Inter-assay CV 4,4% (4,15% CV pro 100000 kopií)
2. Relativní kvantifikace
* Nevyžaduje externí standardy
* Srovnání Ct jednotlivých vzorků (genů) (např. u pacienta po léčbě) s expresí
Kvantifikační strategie
referenčního genu (housekeeping gene) a vůči biologické kontrole
* (např. pacient před léčbou, zdravý člověk...)
* Kontrola = tzv. kalibrátor
* Určení poměru exprese
- Ct
- Korekce účinnosti PCR
- Hodnocení skupin vzorků ­ software REST/REST XL
2. Relativní kvantifikace Ct
Kvantifikační strategie
Bez zahrnutí efektivity jednotlivých reakcí
Předpokládáme 100%
R= 2-[Ct sample-Ct control]
R=2-Ct
vzorek c-fos GAPDH Ct Ct R
A
B
c-fos
A 22,00 18,18 3,82 0 1
B 22,34 15,76 6,58 2,76 1,15
0,5
1
1,5
Nenormalizovaná exprese c-fos
A B
GAPDH
0
0,5
1
1,5
A B
Normalizovaná exprese c-fos vůči GAPDH
0
A B
Kvantifikační strategie
Korekce relativní kvantifikace zahrnující účinnost PCR
Ratio = (Ecílový gen)Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)Ct referenční gen (kontrola-vzorek)(Ereferenční gen)
Ratio = (Ecílový gen)Ct cílový gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
(Ereferenční gen)Ct referenční gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
Ratio = (Ereferenční gen) Ct vzorek (Ereferenční gen) Ct kalibrátor
÷Ratio = (Ereferenční gen) (Ereferenční gen)
(Ecílový gen) Ct vzorek (Ecílový gen) Ct kalibrátor
÷
Účinnost PCR
I malý rozdíl v účinnosti PCR mezi stanovovaným genem a referenční kontrolou může
dramaticky změnit výsledný poměr
Např. rozdíl v účinnosti (E) = 3%
Kvantifikační strategie
Např. rozdíl v účinnosti (E) = 3%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 47%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 209%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 28%
= 5%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 338%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 7,2%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 1083%
= 10%
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Pacienti: dCt=32-26 = 6
Kontrola: dCt=35-27 = 8
ddCt: 6-8 = -2
Poměr exprese: 2-ddCt = 4
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 80%; (GAPDH) 90%Efektivita PCR (YFG) 80%; (GAPDH) 90%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,83 = 5,832 = 3,07Ratio = 1,8 = 5,832 = 3,07
1,91 1,9
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 60%; (GAPDH) 105%Efektivita PCR (YFG) 60%; (GAPDH) 105%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,63 = 4,096 = 1,998 !Ratio = 1,6 = 4,096 = 1,998
2,051 2,05
!
Kvantifikační strategie
Normalizace v relativní kvantifikaci
Sample-to-sample variation
Run-to-run variation
Korekce variability mezi jednotlivými vzorky, způsobenéKorekce variability mezi jednotlivými vzorky, způsobené
* Charakterem vzorků
* Integritou RNA
* Efektivitou RT
* Pipetovací chybou
Normalizace vůči
* Neregulovanému endogennímu referenčnímu genu
* Celkové buněčné RNA/DNA
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Kvantifikační strategie
GAPDH
Albumin
Aktin (y)
GAPDH je regulovaná za nejrůznějších experimentálních i
fyziologických podmínek
Experimentální Tkáň Extracelulární OnemocněníAktin (y)
Histon H3
Tubulin (y)
Cyklofilin
Mikroglobuliny
Ubiquitin
Experimentální
podmínky
Tkáň Extracelulární
faktory
Onemocnění
Věk
Apoptóza
Buněčný cyklus
Vývojové stádium
Hladovění
Hypoxie
Oxidativní stres
Těhotenství
Sérum
Leukocyty
Erytrocyty
Střevní biopsie
Endothelie
T-lymfocyty
Thyrocyty
UV
IL2
NO
TPA
Dexamethason
Cholinergní agonisté
Kreatin
Inzulín
Retinová kyselina
Růstový hormon
Vitamin D
Karcinom
- prsu
- cervixu
- kolorekta
- plic
- jater
- prostaty
- slinivky
Neurodegenerativní
onemocnění
18SrRNA
28SrRNA
Pseudogeny ­ specifická amplifikace nezávislá na mRNA
Vitamin D
MnII+
onemocnění
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Programy geNorm a BestKeeper (freeware)
Určení expresních profilů více housekepingových genů,
zhodnocení jejich variability (pairwise correlation),
geometrický průměr více opakovánígeometrický průměr více opakování
Vyhodnocení nejstabilnějšího housekeepingového genu za definovaných podmínek.
Jak na to?
Tkáňové kultury
­ normalizace vůči počtu buněk, referenčnímu genu, RNA...­ normalizace vůči počtu buněk, referenčnímu genu, RNA...
­ replikáty
Mononukleární krevní buňky
­ heterogenní populace
­ FACS ­ normalizace vůči počtu buněk definovaného typu
­ kvantifikace vůči expresi genu pro příslušný CD (CD-19 B-lymf.)
­ totální RNA
Kvantifikační strategie
Jak na to?
Biopsie solidních tkání
- Nádorová tkáň
- Heterogenita
- Otázkou je, zda-li je vůbec objektivně možné relativně kvantifikovat klasické biopsie
(problémy s referenčním genem a jeho expresí v daném místě, počtem buněk...)(problémy s referenčním genem a jeho expresí v daném místě, počtem buněk...)
Laser Capture Microdissection
- Normalizace exprese vůči referenčnímu genu
- Výhodou je histologická informace a znalost počtu buněk
Celková RNA
- Nutné přesné určení koncentrace RNA- Nutné přesné určení koncentrace RNA
- Nereflektuje RT a PCR krok
rRNA
- Jiný charakter exprese, jiné polymerázy, atd.
- Její hladina je ale ovlivněna méně než v případě mRNA
(s výjimkou krevních buněk)
- Otázka volby subpopulace (28S, 18SrRNA)
D'Souza et al. BMC Neuroscience 2008 9:66 doi:10.1186/1471-2202-9-66
Design experimentu
Jak navrhnout správný experiment?
­ Definovat jej před vlastním začátkem experimentu
­ Brát v úvahu hypotézu
­ Být maximálně jednoduchý (co nejméně komplexní)
­ Maximálně kontrolovatelný­ Maximálně kontrolovatelný
­ Technicky a ekonomicky proveditelný, statisticky vyhodnotitelný
Nežádoucí
Technická: zpracování vzorku (sampling, izolace, RT-PCR)
Řešení: replikáty, normalizace k internímu standardu
Variabilita dat
Biologická: rozdíly mezi vzorky (bazální exprese, odpověď na treatment)
Řešení: opakovaná měření, normalizace ke kontrolní skupině
Hledaná
Rozdíly mezi testovanými skupinami
Náhodný sampling, velký soubor
Kvantifikační strategie
Statistické vyhodnocení
Nulová hypotéza (není rozdíl), kterou se test buď potvrdí nebo vyvrátí
Základní statistické parametry ­ průměr  SD nebo medián  x-percentil
Parametrické testy
- Normální rozložení
- Stejný rozptyl
- Dva vzorky t-test (one/two tailed)
- Různé nezávislé proměnné - ANOVA (i tehdy, není-li rozložení úplně Gaussovské)
Genová exprese (expresní poměry) mívá obvykle Normální rozložení,
pokud je vyjádřena v log2 měřítku.
Neparametrické testy
- Neznáme parametry rozložení
- Testování rozdílů mezi nezávislými skupinami (Independent samples)
dva vzorky, u kterých porovnáváme průměry některé z proměnných
Kvantifikační strategie
Statistické vyhodnocení
dva vzorky, u kterých porovnáváme průměry některé z proměnných
- Mann-Whitey U test; Kolmogorov-Smirnov test
více skupin
- Kruskal-Wallis test; Mediánový test
-Testování rozdílů mezi závislými skupinami
- Porovnávání proměnných, zjišťovaných na jednom vzorku
- Wilcoxonův test (parametrická alternativa ­ t-test/ANOVA)- Wilcoxonův test (parametrická alternativa ­ t-test/ANOVA)
- Hodnoty typu ,,mRNA přítomná/nepřítomná" (dichotomické hodnoty) ­ McNemarův 2 test
-Testování vztahů mezi proměnnými
- Regrese a korelace (Spearmanův/Pearsonův korelační koeficient) R2
- Standardní křivky
Kdy použít který test
Parametrické vs. neparametrické testy
RT-PCR
Kvantifikační strategie
Statistické vyhodnocení
RT-PCR
Obvykle malý počet hodnot, s velkým rozptylem, většinou nesledujících normální rozložení
-> neparametrické testy
V případě většího počtu hodnot (>100), lze použít parametrické testy
Neparametrické testy jsou méně náchylné k -chybám (nesprávné zamítnutí nulové hypotézy), ale
jsou méně citlivé než parametrické (např. srovnání p u para < p u neparametrických testů), jakojsou méně citlivé než parametrické (např. srovnání p u para < p u neparametrických testů), jako
signifikantní najdou větší rozdíl než parametrické testy.
Statistické vyhodnocení
Kvantifikační strategie
Analýza více genů/vzorků (clustering)
Dvourozměrný graf Třírozměrný grafDvourozměrný graf Třírozměrný graf
100
150
200
250
300
0
50
100
0 20 40 60 80 100
Statistické vyhodnocení
Kvantifikační strategie
Analýza více genů/vzorků (hledání trendů, clustering)
N různých genů ­ n různých proměnných ­ n rozměrný graf ?
Př. 10000 genů... (microarray)
Principal component analysis (PCA)
Redukce počtu rozměrů (dimenzionality) na základě
výpočtu kovariance mezi jednotlivými vzorky.výpočtu kovariance mezi jednotlivými vzorky.
Původní osy jdou nahrazeny tzv. komponentami
Statistické vyhodnocení ­ shluková (clusterová) analýza
Kvantifikační strategie
Dendrogramy
Statistické vyhodnocení ­ shluková (clusterová) analýza
Kvantifikační strategie
Self organizing maps (ANN, Kohonen)
www.multid.se
Shrnutí - práce s daty
Kvantifikační strategie
Kontrola dat (outliers)
Úprava efektivity PCR
Kompenzace variability mezi jednotlivými PCR (inter-plate calibration)
Normalizace na stejné množství vzorku (RNA/DNA)
Průměrování technických replikátů
Výpočet množství/poměrů
Statistická analýza variability
Shrnutí
Kvantifikační strategie
Umíte odpovědět na následující otázky?
­ design experimentu, např. je vzorek tkáně reprezentativní? Jaké
biologické kontrolní vzorky musím použít?
­ volba metody, jaký templát bude vstupovat do mých reakcí?
mám použít pouze poly-A RNA nebo celkovou RNA? Má
dostatečnou kvalitu? One step nebo two step PCR?
­ s jakou účinností běží moje PCR?
­ absolutní nebo relativní kvantifikace?
­ je zvolený housekeepingový gen vhodný?
­ proběhla má real-time PCR správně? Jsou Ct stanoveny správně?
­ mám představu o statistickém vyhodnocení mých dat
­ jaký má výsledek mého experimentu biologický význam?