EVROPSKÁ UNIE k^ ^^ ^řr 4T MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost IMI investice do rozvoje vzdelávaní Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR n nH ., III. I nstrumentace Instrumentace PCR - termocykler qRT-PCR - termocykler kombinovaný s fluorimetrem i*' 1 Emisní filtr v 1 m i i—x—-.: p Detektor Instrumentace Zdroje excitačního záření Halogenová lampa - Všechny vlnové délky viditelného světla (320nm - 2600nm) - Uniformní excitace - př. ABI 7300, 7500, Stratagene Mx4000/Mx3000p, BioRad iCycIer - Normalizace fluorescence (Rox) Emission Spectra of Fluorophores far Multiplexing Laser - Specifická vlnová délka - Není nutný excitační filtr - Omezený výběr fluoroforů - př. ABI PRISM 7700/7900 ŕ 1 Elektroluminiscenční diody (LED) - Úzké pásmo vlnové délky (30-40nm) - Běžné LED emitují na 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm - nově i modrá a U V část spektra - př. Corbett Rotor-Gene, Roche Light Cycler «H ľ\j n f 1 1 P \\ \ r' \ f \ (\ C*LRuiv*GůTíJi4a í | \ í \ CAL PuůrSOrarigí SK ľ \í \ QläurS 570 i \i \ cw. fiuousm«; 5W f J \ j \ CM Fluor» K*d 610J f R \ 3§.FIuwt£ft«IŮJH f \ ^u4«T0 / / Qumr&TO j J J ß* m ^ - - J -^---7---- s» «o 7W 7W Instrumentace Filtry Excitační/emisní - selekce excitační/emisní vlnové délky Optická kvalita filtru často určuje výkonnost přístroje Bandpass a Long Pass Filtry Volba fluoroforu Optimizing Fluorescence Signal with Filter Combinations Fluorescence Filter Spectral Profiles 100 300 400 500 €00 Wavelength (Nanometers) 700 lOOr ao -so - 40 -J 20 e- o Venus (a) FITC J-filter Set ilOD fb) ■ ftQ Wideband YFP H 60 Filter Set j 4Q S 400 450 50O 550 COO 3 Wavelength (Nanometers) pl00r---------=—==------------ TRITC Fitter Set -L. 450 50O 550 600 650 Wavelength (Manometers) -i100 ^_ Q i? Texas Red Filter Set 450 £00 550 Č 00 650 700 Wavelength (Nanometers) 80 60 40 o 500 550 600 650 700 750 Wavelength (Nanometers) i http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/imagingsystems.html Instrumentace Monochromator Volba libovolné vlnové délky Difrakční mřížka Fotodetektory Snímací zařízení (CCD) Incident beam Grating Monochromatic boam Instrumentace Teplotní uniformita Saciplí iĽb== C rlliĽĽÍÍÍ "ľlans jSLHir Lizhi íDTHce wincobiz.com/qpcr.htm R£i= Kinross Q -^Y- '.::.'..:-. Mulliwell plate mount Circuit lionrd [Peltier eleniRntsJ '—Therrria-Bnsc layer Coaling element ■ ! k Jl"ílJ 'S-* ' " TUMTITlm Instrumentace Parametry RT cyklem Citlivost- minimální kvantifikovatelné množství templátu - fluorescence, kterou je přístroj schopný odlišit od úrovně pozadí (šum) Dynamicky rozsah - rozsah koncentrací - rozsah intenzity fluorescence Linearita- intenzita fluorescence je lineární ale: - koncentrace: - vysoká koncentrace vzorku - nemusí dojít k excitaci - i u „normálních" koncentrací, může dojít k preferenčnímu absorbování světla povrchovými vrstvami vzorku, vzdálenější část vzorku už není excitována světlem o stejné intenzitě - optická dráha - laboratorní plastik - homogenita vzorku Fluorescenční standardy - kalibrace přístroje Correct Liquid is at bottom of well. Incorrect • Not centrifuged with enough force, or • Not centrifuged for enough time Instrumentace Kalibrace m CCD ContrglrSelbngB Exposure Time (hib) pB3 Lunp Cöhltol Capture knags Ram Ü Fl»rA T RiwtB r FilterC r RH« Q T RH« E Ptcel Irrtehafy i* Walk Found .-«111=1 oie .al:Ľa'ior Wasks Loaded------ Fifler A. Mask Required FiHaiB Mask Required Fitlsr C: MůekRsquired Fitiei D: Ma-ak Rsqwrad FjHei E: Mash; Recwired /äotupY |rcstMino!"ryRt*uHa\ Vi.;■■■ /Spectra v ■: Flr! \firvi Ti»ti lntfriment Analys Windei hpfi j ö . a ii a b B > «í Raw Data M« FUK tw | D Applied Biosystems Real-Time PCR System Spectral Calibration Kit 7300,7500/7500 Fast system Pure Dye Plates (FAM™, JOE™, NED™, ROX™, SYBR® Green, TAMRA™, and VIC® dyes) SDS System Filters Spectrum (nm) Emission Spectra Pure Dyes • SYBR Green ROX] CY5 TEXAS RED EVROPSKÁ UNIE k^ ^^ ^řr 4T MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OP Vzdělávání MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost IMI investice do rozvoje vzdelávaní Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR IV. Interkalační barviva a sondy Fluorofor (F) Fluorofor-většinou heterocyklická nebo polyaromatická sloučenina, při přechodu z excitovného do základního stavu fluoreskuje Excitace Základní stav Fluorescence 10-9 sec. Fosforescence 10-3 sec. Relaxace Excitovaný stav Zhášení nebo přenos energie Vnitřní konverze Fluorofor (F) BHQ-1 TAMRA A Flu lexa 1 :AM TET JOE Ya Yé kima ?llow HEX Cy3 ÄTTO550 TAMRA ROX Cy5 C :y5.5 Max Em (nm) 442 520 536 548 549 556 563 576 588 605 662 707 Max Abs (nm) 346 494 521 520 530 535 546 554 556 575 646 683 Fluorofor (F) Fluorescenční kvantový výtěžek (Fluorescence quantum yield, QY) - poměr emitovaných fotonů k absorbovaným. Molární extinkční (absorpční) koeficient -jak silně daná látka absorbuje světlo o dané vlnové délce A=ecl Stokesův posun; Jablonského diagram 0 o 0 Ü c/) 0 o £Z 0 Stokes shift <-------------► ------------1 / 1 Excitace i / i------------ / 350 400 450 500 Vlnová délka [nm] Emise 550 600 650 S'1 Excitace Absorpce hmex S'1 -^>S1 Disipace části energie S1 hrnem Přechod z S1 do SO a emise fluorescence so Jablonského diagram Základní stav Quenchers - Zhášeče (Q) Zhášení-quenching • Redukce QY v daném fluorescenčním ději • Absorpce nebo disipace energie - návrat fluoroforu do základního stavu bez emise fluorescence Proximální zhášení - kolizní quenching • Fluorofor velmi blízko zhášeče - přenos energie z F na Q ve formě tepla -nenastane žádná fluorescence • Proximálnízhášeče: molekulární kyslík, Cu2+, Mn2+, NO3- Excitation Fluorescent emission \ luorothromt! Excitation Fluorochrom e http://www.etswebsite.be/ Fluorescenční rezonanční energetický transfer (FRET) Základ řady experimentálních metod v biochemii a molekulární biologii • Přenos energie z donorové na blízkou akceptorovou molekulu, donor se vrací do základního stavu bez vyzáření fluorescence; akceptor vyzáří energii ve formě fluorescence • Emisní a absorpční spektra se musí překrývat • Försterova vzdálenost obv. 100Á • Energie, kterou donor vyzáří nebo předá musí být dostatečná k excitaci akceptoru • Příklad: FAM-TAMRA, DABCYL, BHQ Donor J (A,) Acceptor fluorescence absorption Wavelength (X) Specifická vs. nespecifická detekce amplikonu Nespecifická - Interkalační barviva - Quencher Labeled Primers - LUX Primers -Amplifluor Specifická Lineární sondy - ResonSense, Angler Probes - HyBeacons - Light-up probes - TaqMan sondy (Hydrolyzační sondy) - Lanthanidové sondy - Hybridizační sondy - Eclipse - Displacement Hybridization/Complex Probes Strukturní sondy - Molekulární majáky - Scorpions - Cyclicons - Nanoparticle Probes - Konjugované polymery a PNA sondy Nespecifická detekce množství amplikonu - Interkalační barviva - Quencher labeled Primer - LUX Primers -Amplifluor Interkalační barviva Reverzibilní vazba na dsDNA • Relativně levné • Citlivé Nevýhody: • Některá barviva se váží na ssDNA • Nespecifická vazba na jakoukoli dsDNA (primer dimery, „mispriming" atd.) • Pečlivý návrh primem a extenzivní validace, disociační křivky Annealing phase + • Extension phase (I) Extension phase (II) «^ ^^^P^ ^ End of PCR cycle ■■ — . "■___________ ___„^____________■ ______w van der Velden et al. Leukemia (2003) 17,1013-1034 Disociační křivky - melting curves " '-nirin 200 / 1 amplikon / ^-. # / v * iBTllTlifll««!« riinoMurilC] ■Ml. 940 / y / 2 amplikony \ * / / \^ / í a «a m m k a* m ba nL""jMJwifinm 0.12 OK i X Žádná amplifikace ■-j**- OM an / 1 y s i/ y i»"'» _/ 0.03 4.41 -0.41 ■0.01 l/ / £: , / \ / / " \ * !------ Hl M M H «1 M M « "■.....■"■"■" | cm Ma CM CM i DXO i s '\ \ A *., \ ä i 1 ř v ^ ^ 'V * M n ;ÍK »a ■ M :*» 4š Interkalační barviva Ethidium bromid 30ti násobný nárůst fluorescence po vazbě na dsDNA Nepravidelná vazba na DNA Qy = 0,15 ^-v^NH2 400 450 500 550 600 650 700 750 Wavelength (nm) SYBR Green SYBR Green II SYBR Gold YO (Oxazole Yellow) TO (Thiazole Orange) PG (PicoGreen) rr"^ rr"^ >1000 násobný nárůst fluorescence Rovnoměrná vazba na DNA Qy = 0,60 Bezpečný o 'ü x OJ u O Q) I I 225 325 425 525 625 Wavelength (nm) Interkalační barviva A) SYBR Green B) Ethidium bromide Quencher Labeled Primers 1 Použití dvou odlišných molekul PNA (peptide nucleic acid) označenou na C konci zhášečem DABCYL (Q-PNA) + Primer se specifickou sekvencí na 3' konci a fluoroforem a PNA komplementární sekvencí na 5' konci Tm primer/amplikon> Tm Q-PNA/primer > Ta primer 1. Nadbytek primem je zhášen při Ta 2. Fluorescence měřená během Ta udává množství primem hybridizovaných ktemplátu /amplikonu plus množství fluorescenčně označených dsDNA amplikonu 3. Real-time i end point CONH i PNA NH HŇ v- coc PROTE .n g © 0=P-O VR S r\ o=p-o V* oj O=P-0 /"■'' ( A DNA °'-* l OH Quencher Labeled Primers Primer >25bp se zhášečem na 5' konci (QSY 7, QSY 9), Molecular Probes-Invitrogen QSY 7/QSY9 zháší fluorescenci interkalačního barviva (SYBR), které se může vázat na primer dimery nebo primer samotný Po prodloužení řetězce není již fluorofor zhášený Redukce pozadí/ nespecifických signálů QSY 7 LUX Primery Light Upon extension - Invitrogen • Reverse nebo forward primer označený fluoroforem. • Ve vlásenkové konformaci zhášený. Druhý primer je neoznačený. • Po inkorporaci do dsDNA je zhášení uvolněno a emitována fluorescence 3' 5 LUX detection i Forward primer isingle-labeled!1 Reisrae primer (unlabeledJ ^p l *J 5' Figure 2 - The LUX (JJght Upon extension) effect 10 ^ ^ S> *£ u ^> ^ S «£ IIP« DT sLjffTC s u*^ »Ti 1 ! ■.'■■h.' d P imar(d ON AJ 1 0.4 SB ä čile- ■■Imi de: £ I'll iř.i 1 1 3 0.1 1 |iin Frin et llai 5 3' PrimeT Conformation Amplifluor http://www.genxpress.at/ • 3 typy primem - Dva specifické pro amplifikovanou sekvenci a jeden tzv. UniPrimer • Jeden ze specifických primem obsahuje univerzální (Z) sekvenci na 5' konci, druhý není nijak modifikovaný • 3'konec UniPrimeru je komplementární k Z sekvenci prvního primem, zbytek směrem k 5'konci tvoří vlásenku označenou fluoroforem (FAM) a zhášečem (DABSYL) • výhoda: každá PCR může být snadno adaptována na Amplifluor PCR, začleněním Z sekvence na 5'konec jednoho z primem • možnost použít dva různě značené UniPrimery s konci komplementárními k odlišným Z sekvencím -SNP analýza/alelická diskriminace UniPrimer xí Amplifluor Cyklus 1: primer se Z sekvencí je inkorporovaný do nově syntetizovaného řetězce 1st Cyklus 2: polymerace z druhého primem inkorporuje sekvenci komplementární k Z do druhého řetězce Cyklus 3: konec Uniprimeru se komplementárně váže 2nd k Z sekvenci, poskytuje volnou OH skupinu polymeráze a je sám začleněn do nově vznikajícího řetězce - uvolňuje se vlásenková konformace Round unimmr^f Cyklus 4: polymeráza uvolňuje vlásenkovou strukturu a celý Uniprimer se stává součástí nového ..................[...........I.......■ Reverse primer %/, Forward primer MINI! ľl MIMI.II,II.II.IUI.II.MIHLI II im mi ni i \h" 11111 r i r i r i r i r i r i r i 11' 11S11' 111SI m 1111 h 11 i 11111 s 11 a 11 s M11 řetězce. Zhášeč je oddělen od fluoroforu a 4th 1 dochází k emisi fluorescence. Od tohoto cyklu je Uniprimer inkorporován do amplikonu Fluorescenční signál je generován v každém PCR cyklu (je snímán během annealingu) a koreluje s množstvím amplikonu. Nezačleněný Uniprimer tvoří vlásenku a nefluoreskuje. ľlľlľll Iľllľ'll M M M MLH III M M M III M III M M \ Amplifluor 3' # X # -* ■me z prlíTier anraafs, and is axtencfed k ma first amplication found __Ô tft) TTie UnRlmer anneals to the sequence of 1he Z prime r and Is extended óy the polyrraerasQ "me UhiRimer-containing p lociuct serves as a template for the other pfimer Bitenston of primer causes tľiô halrph to untold and to separate me reporter and quencher. Tne reinorrer fluoresces O Vo fj Reporter ^J Qusnchar Specifická detekce množství amplikonu Lineární sondy -ResonSense, Angler Probes - HyBeacons - Light-up probes TaqMan sondy (Hydrolyzacni sondy) Strukturní sondy - Molekulární majáky - Scorpions - Cyclicons - Nanoparticle Probes - Lanthanidové sondy - Hybridizační sondy - Eclipse Displacement Hybridization/Complex Probes - Konjugovane polymery a PNA sondy Reson Sense & Angler Probes www.dstl.gov.uk - urychlení qPCR - optimální fluorescenční signál již po 5 sec. v annealingovém kroku - DNA interkalátor (SYBR Gold) - FRET donor + sonda specifická k jedinému amplikonu - FRET akceptor (Cy5 na 5'konci) - buď volně (ResonSense) nebo připojena k primem linkerem (Angler Probe) - DNA polymeráza bez exonukleázové aktivity v případě ResonSense - Pokud není přítomná cílová sekvence, nebo během denaturace, není SYBR a Cy5 v dostatečné blízkosti aby došlo k FRET a emisi fluorescence - kvantitativní PCR i alelická diskriminace (více různě značených sond) ex495nm em 537nm ex495nm oiono SYBR gold em 695nm ()I(')N() SYBR gold HyBeacons www.lgc.co.uk • Velmi jednoduchý princip i design • Sonda emituje fluorescenci pouze v duplexu s DNA • P na 3'0H konci - není volná OH skupina pro polymerázu • Snímání fluorescence v annealingovém kroku • Bez nutnosti FRET, návrhu sekundární struktury nebo enzymatického štěpení HyBeacons CTGTATTCCTCGCCTGTCC NNNNNGACAT AAGGAGC GGACAG GNNNNN CTGTATTCCTCGCCTGTCC IIIIIIIIII-IIIIIIII NNNNNGACATAAGGAACGGACAGGNNNNN Tm = 55.4°C Tm = 45.5°C 8 -i 7- %s^**^ G - www.lgc.co.uk Light Up Probes • Podobné HyBeacons • PNA s konjugovanou thiazolovou oranží (asymetrické cyaninové barvivo) • PNA neinterferuje s PCR • Nízká fluorescence volné sondy - nárůst po vazbě k DNA (annealingový krok - snímání fluorescence) • SNPs (jediná báze) R-Nhľ o V 'M' H ,X X-TO PNA YYVk H„C TO^M TON" Target DNA 5' 3' I TI Light Up Probes Svanviket al. 2000. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry 281, 26-35 . Hydrolyzační sondy (TaqMan Probes) • 5' nuclease assay • Velmi populární design a univerzální použití • Fluorofor na 5', zhášeč na 3' konci (snadná syntéza) • 5'-3' ds exonukleázová aktivita DNA polymerázy • F-Q - FRET (TAMRA) nebo emise tepla (BHQ) • Pokud je přítomen templát, sonda se komplementárně váže na cílovou sekvenci - annealing • Hydrolýza sondy během extension fáze PCR (rozdíl od předchodzích), uvolnění fluoroforu a ireverzibilní emise fluorescence /"~\ • Nenavázaná sonda zůstává intaktní a nedochází k fluorescenci • Je nutné sladit annealingovou teplotu proby s optimální teplotou polymerázy ©o © Q •Q • Sloučení annealingového a extension kroku do jediného, obvykle 8-10*0 pod Tm sondy (60-620) • Kvantifikace, SNP, alelická diskriminace atd. • Multiplexní reakce UPL sondy • Podobné TaqMan sondám • Sekvenčně specifický pár primem + semiuniverzální sonda - knihovna • Do sekvence sondy začleněna Locked nucleic acid (LNA) - zvyšuje teplotní stabilitu -Trn LNA Monomer ß-D configuration Perfect Match Single Mismatch Ol „ 3' -ACGACCAC-5' ^-ACGGCCAC-S' ATm LNA 8-mer S'-TGC GGTG-3' 71X 45X 26X p crpo DNA 8-mer S'-TGC GGTG-3' 35X 25X 10X Lanthanidové sondy • varianta hydrolyzačních sond (TaqMan) • fluorescenční zančka - lanthanidové cheláty (terbium, europium) s molekulami, schopnými absorpce UV-úzké emisní spektrum, • zhášeny ssDNA- rádový nárůst fluorescence po hydrolýze sondy • time resolved FRET - odečet fluorescence po určité době od excitačního pulzu - snížení fluorescence pozadí • další snížení zbytkové nespecifické fluorescence pomocí krátké sondy se zhášečem - do cyklu je zařazen krok ßö'C kdy se váže sonda se zháše čem na nenavázanou reportérovou sondu • kombinace s klasickými fluorofory liui 60CC~62°C 35aC i ifc.1.'.........■» ® Lightcyder - Hybridizační sondy dva oligonukleotidy, navržené tak, aby hybridizovaly na templátu vedle sebe fluorofory tvořící FRET pár pouze po úspěšné hybridizaci dojde k emisi fluorescence FRET - Sondy nehybridizují v dostatečné blízkosti - nedojde k FRET --------------------------^ Emise fluorescence O signál Emise fluorescence O X signál kvantifikace, genová exprese, SNP Eclipse • Lineární sondy, podobné TaqMan • 3' konec - fluorofor, 5' MGB protein a zhášeč • Nejsou hydrolyzovány Taq polymerázou • Pokud není Eclipse sonda hybridizována ktemplátu, zaujímá konformaci, ve které jsou fluorofor a zhášeč v těsné blízkosti • Přítomnost MGB zvyšuje účinek zhášeče - redukce fluorescence pozadí a umožňuje konstrukci kratších sond s vyšší Tm h an frlact Ecipsô probe, ähe repůrtei Is quartcneci when ft close promnify lo quenciw Durtig annealing, t» prate unfolds and binds i to me target secjusnce to separate in* reporter and quencher. Tne reponier luoresces ^p Reporter ^J cxjůnciw rtn Mlnůrgioůvů btnťi&r Displacement Hybridization/Complex Probes • v reakci kromě sondy a templátu je navíc kompetitor • kompetitor blokuje nespecifickou hybridizaci sondy k podobným sekvencím, nezasahuje do hybridizace mezi přesně odpovídajícím templátem a sondou • SNP - diskriminace rozdílu i v jediné bázi • fluorescence se měří v annealingové fázi ] + matched target ale S1 + mismatched target li if 1 H m i i ♦ ■ Molekulární majáky/ Molecular beacons Target 3'_______________5' + ŕ ^j Molecular \^ / beacon I Reporter Quencher • vlásenková struktura, konce jsou vzájemně komplementární; smyčka je komplementární k cílové sekvenci • konce označeny fluoroforem a zhášečem • ve vlásenkové konformaci je fluorescence zhášena • po vazbě na komplementární templát dochází k emisi fluorescence • fluorescence je odečetena v annealingovém kroku • po zvýšení na extenzní teplotu, sonda disociuje a nebrání polymeraci • Stratagene * Molekulární majáky/ Wavelength shifting beacons • sonda má na jednom konci navázané dva fluorofory - tzv. „harvester" a „emitter", na druhém konci zhášeč • harvester absorbuje světlo, emitter díky FRET fluoreskuje • výrazně jasnější výstup než klasické majáky (v případě běžných zdrojů monochromatického světla) ^ 6-carboxyrhDd-amine 8-6 Tetramethylrhodamine T-exas- red 500 550 600 650 550 600 650 Emission wavelength (nm) 550 600 650 B C-carbüHyTtiDdarnine ŮG TelFamethylrtiodamine j___i___i___i_ "i'"i-..j--' i___L j___i___i___i_ 600 500 600 Excitation wavelength (nm) + '...... S Wavelength-shifting molecular beacon Target Hybnd Texas red Katalytické molekulární majáky • Molekulární maják je kombinovaný s DNAzymem • Lineárni oligonukleotid (sonda) značený fluoroforem a zhášečem, intramolulekálrně komplementární k DNAzymu • Absence cílové sekvence - maják intramolekulámě hybridizuje s DNAzymem a alostericky inhibuje jeho aktivitu; sonda není štěpená • V prítomnosti cílové sekvence DNAzym štěpí sondu, odděluje zhášeč a dochází k emisi fluorescence • Modulární design umožňuje různé assaye 480 nm —^ p y"ŕ í-^ 31 520 nm Č G 520 nm no cleavage AT CG AT TAT A rA deoyyríb02ymoV -j, modulů G 430 nm ^^ t G A PäF T 1 rA A P-A- „T P-c 9CA CMB-1 A A-t"'G-C-G-A :, G AT \ A G C \ llunmpnn/r praar Scorpion primers Nízké pozadí Rychlá analýza Jednoduchý design SNP - vysoká citlivost Multiplex Jednoduchá příprava Scürpi-Dns Molecular Beacon TaqMan w o e OJ O É The Scorpions reaction Step L - the scorpions primer is extended on target DNA, **------------^ w------w »"■ ............ Step 2 - the extended primer Is heat denatured - the quencher disassociates. Step 3 - as It cools the extended scorpion rearranges and begins to fluoresce In a target specific manner; unexpended primer i$ quenched. v-----0-----* «a. Cyclicons • Pseudocyklické oligonukleotidy (PCO) - dva oligonukleotidy spojené v oblastech 3'-3' a 5'-5' • Jeden segment je komplementární k cílové sekvenci • Druhý segment 5-8 nukleotidů je komplementární k 3' nebo 5' antisense oligonukleotidu • Pokud není přítomný templát, PCO tvoří intramolekulární pseudocyklické struktury, Quencher--------9 s------Modifier scgnnc-111 ^-^i^.— Fluorophort TfirjEi JÍ y C 2DU- a i ň a i e. ů 9-0-----O-----° Ö —i------1------1-------1------r o 5 io jj 20 a Onncrtitration, \i3A 5on sin Í4Ů ÍM> 530 «W ň2D Mfl Wavelength. iiM l 2 i 4 J Sumple Sondy založené na nanočásticích (nanoparticles probes) • Hybridní materiály složené z biomolekul (oligonukleotidy) a anorganických látek- např. zlaté koloidní nanočástice (polovodičový charakter) • kovové clustery - efektivní zhášeče • hybridní konjugát - ssDNA oligonukleotid, 1,4nm zlatá nanočástice a fluorescenční barvivo • 5' a 3' konce oligonukleotidu jsou vzájemně komplementární, struktura podobná molekulárnímu majáku Výhody • Au nanočástice zhášejí fluorescenci např. 100x účiněji než DABCYL a mají téměř 100% účinnost zhášení pro fluorofory absorbující v IR části spektra (Texas Red, Cy5) • V přítomnosti cílové sekvence se vlásenka otvírá, odděluje se F a Q a dochází k emisi fluorescence Nevýhody • Nižší citlivost - řešení změna velikosti nanočástic, Surface plasmon resonance • Změna absorpčního spektra v závislosti na vlnové délce • Vazba Au-DNA Target 3' .5' Molecular beacon Reporter Quencher O Au nanoparticle 3' t>* — ujuij nitnrr— \ Konjugované polymery a PNA sondy • Cíl - zjednodušení syntézy sond, zvýšení citlivosti • Vývoj kationtových konjugovaných polymerů CCPs • Delokalizovaná elektronová struktura, vazba na DNA • PNA sonda s navázaným fluoroforem • V případě tvorby ideálního duplexu DNA/PNA, se CCP dostává do blízkosti fluoroforu a dochází k FRET • Pokud není cíl přítomný, CCP se váže pouze na DNA a dochází pouze k fluorescenci CCP, ne FRET • Efektivní detekce SNP Fluorescence po excitaci CCP komplexu Fluorescence po přímé excitaci fluoresceinu A Wild Type (WT) B Mutant (RW) 0L1111 N-term a. 4D0 45Ü 5(10 550 6Q0 6í WavBlöngth (nm | 520 540 560 580 Wavelength (nm) Shrnutí - Princip fungování real-time termocykleru - Základní principy excitace a emise fluorescence, FRET, zhášení - Interkalační barviva - Lineární a strukturní sondy - Hydrolyzační sondy (Taq-Man) ^^^^^^^ ^T^^ I MINISTERSTVO ŠKO EVROPSKÁ UNIE W^ ^0 I mládeže a tělovýc ť. <í &!*?k. IMI MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, OPVidéiávání ^ m ^ MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 4JíAv * INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky