EVROPSKÁ UNIE 5Sf ^řr A' MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, Op Vzdělávaní MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INI í INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primerů a sond Design primem a sond Hybridizace Úspěšný annealing sondy a primem je kritický předpoklad úspěšné PCR - Sekvence - Koncentrace solí - Tvorba heterodimerických stabilních struktur - Párování baží - nejen Watson a Crick - Sekundární struktura - Teplota tání DNA Trn Design primem a sond Adenine Třiyrnine fi J Guariina Cytosirie Sugar phosphate backbone U.S. National Library of Medicine Adenine Thymine V k/- Phosphate- 0 V o H2II r**=o deoxyribose &7VS { backbone - i^V>XÍ V ,« y ♦ 3'end Guanine Cytosi 5'end Design primem a sond H \ s» i*. H N—H--Q v: 5- »> t ( í>J -H—N ^>Q cW"Mw^ M H H O- -H—N S- «ŕ \ H N-H —N 7^Nn „H eykwittt guteď* Ihyroinc mienim: {*> Q A- 8> i ,N .O—H—N H£K_r>-\ N—H H :!■! Vlhi IM n,' UriKÍl N^N.H--0 R H 0 H Watson-Crick l JVH-H N> /V" RN^N^NH-n;C>-H H O H HNH H O H Reverse Watson-Crick H H n^Nh0Ah H-íŕ „ \ T u I 1hÍ>h-hV» mJÍh ° R M A*U Hoogsteen O H HNH G-U Wobble H ?""~N\ N NH-N Cj~H l~^AX H-N H N^fN"H H N-\. R H A'C Reverse Hoogsteen H R N "HO Ň H w ° R H A*U Reverse Hoogsteen O R S—N H-0 H H ^N N-H H G-U Reverse Wobble y-N HrNw'H' W í,-_/A---H-N H R N=^ H H A'C Reverse Wobble Design primem a sond Melting temperature Tm •jeden z nejdůležitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm - teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperative melting" - usnadněná denaturace po disociaci prvního páru baží • Sekvence: A=T < G=C • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovými molekulami • kationty maskují náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) Tm=81,5+16,6 (log10[Na+]+0,41(%GC)-(625/l 50 Web-based kalkulátory http://insilico.ehu.es/tm.php Temperature B rel. abs abs.fn abs.[25*C] Design primem a sond Melting temperature Tm 100 i i i i i * / / í 80 - Trn lower in lower salt / / / ■^f c 60 i— concentration + 40 (U É / C Tm higher in S 20 / / / / / higher salt concentration 0 e J 1 1 j j >o 70 80 90 100 110 rm,*c GCTÄTTCAACTGäAGAGGGCäCäGC + CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG Tm - 25' f >T m GCTATTCAACTGGAGÄGGGCACAGC + CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG t:-25° >T m CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG GCTATTCAACTGÄAGAGGGCÄCAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG T note: T^ is 4 lower than Tm (In general, there is a 1° drop for every 1 % mismatch) Design primem a sond Gibbsova (volná) energie a její změna (AG, AG0) • Sekundární struktura DNA • Na rozdíl od Tm, AG závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie AG° (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teoploty a tlaku) - spontánní reakce - AG<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování baží, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček - predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions - smyčky, vlásenky, vyduté atd. C T T T C A TT—A G — C G—C A A — T C — G T —A G—T B ~—T* C —G C G—T n ▼c—č* A — T D G G / \ľ U —A G—C E o—c ( ; A A A*C-G#ř C—B A A A A A A A G G — C G — C 0 — C H A U — A A U—A C—C 1 Design primem a sond Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 1. Počet odpovídajících párů baží Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence - nearest neighbor 3. Sekundární struktura Charakter cílové sekvence Kompetice primem nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konpef "^^ InterakcWnez 5' a 3"konci hybridizovaneho ohgonukleotidu a nejbližší sousedící báze - Příklad: AG° (GC) -6,96kcal/mol ) GTAGACAATCTCCATCTCCTATCCTGATTAGAG ^^^^ ^^r ******************** AG0 (AT) -0,50 kcaFmoT GTTAGAGGTAGAGGATAGGA AG° W-C (TA/AT) -0,58ckcal/mol AG° W-C (GC/CG) -2,24 kcal/mol Design primem a sond Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 5. Iontová síla Koncentrace iontů, zejména Mgll+ Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu Stabilita duplexu (Trn) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA- vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Trn, ale shodná účinnost hvbridizace obou primerů. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou AG°, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající AG°. Design primem a sond Design primem Optimálně: primery jejichž 5'konce tvoří stabilní duplex, AG°<10 kcal/mol/Sľ'C Plynulý přechod AG° směrem k 3'konci až k cca -6kcal/mol. Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3'konce) Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury Komplementarita primem - primer dimery Specifita - hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí - i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR - vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR \ Primer / illllllllllllllllllllllllllllllllll i!A|ftMtJllII|||||||||||||||Ill i " Prirnpr * Region of DNA to ^ be amplified by PCR ATCCTATGGTTGTTTGGATGGGTG Design primem a sond Design sond Různý design podle toho, zda je cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP Použitá chemie Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy - LNA, PNA, MGB atd. Multiplex assay Design primem a sond Design hydrolyzačních sond KNH qPCR TaqMan - dvoukrokový prodes - denaturace a annealing/extension Co nejnižší Ct a nejvyšší AR (ARn) Umístění 5' konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3' konci jednoho z primem - účinné štěpení sondy Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% \i J AT bohaté sekvence - začlenění LNA, PNA nebo MGB G - účinný quencher - neumisťovat fluorofor na G Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice Tm proby od lO'C vyšší než Tm primer ů ch2oh r^r^f^ OH OH Q o© 2923 Design primem a sond Design hybridizačních sond Sondy by měly být umístěny co nejdál od primem 5' - odečet fluorescence v annealingové fázi • GC 50% Každá sonda má délku 23-35bp Sondy o stejné Tm - musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10'C vyšší než Tm primem 3' konec akceptorové sondy fosforylován Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycier Red 640/705 Vzdálenost mezi sondami 1-5 baží (zajištění FRET) (Lightcycier probes) Tampfate DNA i m t i í J i r Excitation lor cfonor i Emission by acceptor Detection '".....I Jmt....." IMMUN JT S"\ ^TY* Temperature Design primem a sond Design molekulárních majáků Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu Tm komplementárních ramen o 7-10*0 vyšší než Tm pr imerů Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers Sonda připojena k 5' konci primeru a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy - Design primem a sond Design primem Délka amplikonu, Tm, účinnost amplifikace i výtěžek Správná sekvence - BLASTn Sestřih - rozhraní exon/intron 3' konec - klíčový pro eventuální mispriming G/C Repetice (zejména GC) Sekundární struktura, intraprimer homology - Obsah GC 35-65% - Délka 15-25bp - Tm 55-60 CJ [tt ][Fwd Start ][FwdStop ][Fwdl_en... ][ FwdTrn ][Fwd%GC ][FwdSeq ][RevStart ][RevStop ][RevLen... ][ RevTm ][Rev%GC ][RevSeq ][Probe |1G2 181 120 58 |55 CGTCTCCA... 217 199 19 58 63 [ňamuroMi A 2 161 180 20 59 60 CCG T CT CC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 182 V 3 161 180 20 59 60 CCG T CT CC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 4 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 5 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 S 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 7 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 8 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 9 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 10 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 11 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 13 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 14 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 15 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 16 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 17 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 18 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 19 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 20 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 21 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 22 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 24 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 25 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 26 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 822 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 28 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 29 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 30 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 31 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 ■ <\ BQ^^^^^^^^^^^^^I 1 > G n lit ľlick to show Locations ľlick to show Secondary Structures Design primem a sond Name Value F£] Forward Primers | Total primers tested: 35792 G C test passed: 35149 Ambiguity test passed: 963 Clamp test passed: 963 Tm test passed: 963 Avoid Excluded regions test passed: 963 Repeat test passed: 900 Self compare test passed: 741 Limit G C test passed: 214 Sequence compare passed: 84 Reverse sequence compare passed: 83 F£] Reverse Primers Total primers tested: 35296 GC test passed: 34657 Ambiguity test passed: 946 Clamp test passed: 946 Tm test passed: 946 Avoid Excluded regions test passed: 946 Repeat test passed: 861 Self compare test passed: 703 Limit G C test passed: 205 Sequence compare passed: 95 Reverse sequence compare passed: 95 F£] Primer Pairs Total pairs tested: 7885 Amplicon Length test passed: 691 Avoid Excluded regions test passed: 691 Tm Difference test passed: 691 Amplicon Tm test passed: 630 F£] TaqMan Probes Total probes tested: 14450 GC test passed: 14128 Ambiguity test passed: 1178 Tm test passed: 1178 Avoid Excluded regions test passed: 1178 Repeat test passed: 1126 Self compare test passed: 1076 Sequence compare passed: 475 Reverse sequence compare passed: 458 Probe start test passed: 351 Design primem a sond A B 1 c 1 » 1 E F « H 1 1 1 1 K 1 L M N | 0 p 0 1 R S 1 T | u 1 v w 1 X V 1 # Pwd Sta rt Fwd Stop |pmd Length ^jfd Tm 53 Fwd%GC 55 FwdSeq FtevStart Rev Stop FtetfLength RevTm RevStGC RevSeq Probe Start ^robeStop Probe Length ĽJŤ] 15 ProbeTm »robeWGC ProbeSeq AmpTm Arr p%GC Am p Ta Am p Len Penalty 2 1 162 131 20 CGTCTCCAGTGCCAACTTCA 2171 1991 Ír 581 63 GGTCCG GACTG GTCGAGAT 133 67 TCCCACGGTCACTGC 34 6l| 62 56 31 3 2 161 130 20 59 60 CCGTCTCCAGTGCCAACTTC 2171 199i| 19 581 63 GGTCCG GACTG GTCGAGAT 132 197| ie 69 63 TTCCCACGGTCACTGC 851 6l| 62 571 36 A 3 161 180 20 59 SO CCGTCTCCAGTGCCAACTTC 217 199 19 58 63 g;t;;;gactgGTCGAGAT 133 197 15 69 67 TCCCACGGTCACTGC 35 61 62 57 36 b 4 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 809 790 2: 59 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 730 16 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 33 57 61 65 77 e 5 745 761 13 55 61 CCCAAGCCCTCAGTG G AA 809 790 2-: 59 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 7G5 731 17 6S 47 TGTCAAGAGCATCAGCA 33 57 61 65 77 7 t 7451 7611 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA S09I 79o| 2-2 59| 55 TCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 7E5 732I 18 H 50 TGTCAAGAGCATCAGCAG 33 571 61 65 77 s 7 bo: 322 231 60 43 AG CCCTTTGATGACTTCCTGTTC 8641 3471 15 B,[ 67 ggagcgggctgtctcaga 3271 3441 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 34 601 62 65 30 9 S bo: 821 23 60 48 nGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 864 847 13 581 &7 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 328 345 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 34 60 62 65 80 lu 3 30G 322 23 63 4B í.p. r r mTG atg a mrfTGTTC R64 HJ7 -11 m» 67 ™ 1" rnn n rrrnr-n-i n t. 3?q Ftdi 17 R9 65 TCATnCAnGCCCAGTGG 34 63 62 65 80 745 762 IS 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 791 2: 58 SO ATCAAAGGGCTCGGTCTTCA 765 730 16 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 33 56 63 6& 52 : ------------■------------" 13 12 7451 7611 üf 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA BIO | 79l| 2-2 5s| SO ATCAAAGGGCTCGGTCTTCA 7651 732I 18 isf 50 TGTCAAGAGCATCAGCAG 33 56f 60J ěěf 32 14 13 7451 7621 13 55 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 8101 79o| 21 591 52 ATCAA4GGGCTCGGTCTTCAG 7E5 7 SC 16 Ě3 50 TGTCAAGAGCATCAGC 33 561 60 66 83 lb H 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 7E5 781 17 63 47 TGTCAAGAGCATCAGCA 33 56 60 66 Si 16 15 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 731 13 63 SO TGTCAAGAGCATCAGCAG 33 56 e: 66 83 17 1? 799 811 13 60 43 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 327 344 13 70 61 CATCňTCCAGGCCCAGTG 34 61 61 66 85 18 17 799 811 13 60 4S GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 864 847 1* 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 323 345 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 34 61 61 66 85 19 15 79g| 82l| 231 60 48 GAGCCCTTTGATGACTTCCTGTT 8641 3471 15 5s| 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 32g| 3451 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTGG 34 611 62 66 35 2U 13 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 2-: 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 765 730 le 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 67 87 n :■: 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 811 792 2-: 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 7E5 781 17 69 47 TGTCAAGAGCATCAGCA 33 57 61 67 87 11 21 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 811 792 2: 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 765 732 13 69 SO TGTCAAGAGCATCAGCAG 33 57 61 67 87 23 22 793 818 21 59 51 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 335I 16 63 50 TTCCCAGCATCATCCA 35 61 61 67 88 24 23 79s| 313 211 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 8641 3471 15 5s| 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 320 33ef 17 ES 53 TTCCCAGCATCATCCAG 851 6l| 62 67l S3 25 2- 733 313 211 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 8641 3471 15 591 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 3211 335 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 851 611 62 67| 83 26 25 793 818 21 59 51 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 821 336 16 69 56 TCCCAGCATCATCCAG 35 61 62 67 88 27 2Ě 793 818 21 59 51 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 322 334 13 69 62 CCCAGCATCATCC 35 61 61 67 88 23 27 793 818 21 59 51 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 327 344 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 35 61 61 67 88 29 :5 79s| 313 211 59 52 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 8641 3471 15 591 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 323 3451 18 7o| 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 851 611 62 67| 83 30 23 793 818 21 59 51 CGAGCCCTTTGATGACTTCCT 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCňGTGG 35 61 62 67 88 31 3: 745 761 13 53 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 811 733 2: 58 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 780 16 68 50 TGTCAAGAGCATCAGC 32 56 e: 63 91 32 31 745 761 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGfiAA 811 733 2-: 58 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 731 17 69 47 TGTCAAGAGCATCAGCA 82 56 60 63 91 33 32 7451 7611 13 58 61 8121 79i| 2-2 581 5C TĽATCAAAGGGĽTĽGGTCTT 7651 732I 13 631 50 TGTCAAGAGCATCAGCAG 32 561 &■:■ 63 92 34 33 797 816 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 820 335 le 63 50 TTCCCASCATCAPCCA 35 611 62 63 91 3b 34 797 816 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 320 336 17 69 53 TTCCCAGCATCATCCAG 35 61 62 63 91 36 35 797 816 20 58 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 321 335 S3& 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 35 61 61 63 91 37 3? 797I 316 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGAĽTTĽ 8641 3471 15 5s| 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 3211 16 69 5& TCCCAGCATCATCCAG 851 611 62 63 31 38 37 797 816 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 13 53 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 322 334 13 69 62 CCCAGCATCATCC 35 62 62 63 91 39 33 797 816 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 13 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 322 336 15 68 60 CCCAGCATCATCCAG 35 61 62 63 91 4U 33 797 816 20 58 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 323 337 15 68 60 CCAGCATCATCCAGG 35 61 61 63 91 41 -■: 797| 316 2o| 53 55 CCGAGCCCTTTGATGAĽTTĽ 8641 3471 18 59| 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 3271 34o| 14 63 &4 CATCATCCAGGCCC 851 621 62 63 31 42 -1 797I 316 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTt 8641 3471 15 591 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 3271 342 16 63 63 CATCATCCAGGCCCAG 851 621 62 63 92 43 42 797 816 20 53 55 CCG AGCCCTTTG ATG ACTTC 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 35 621 62 63 91 44 43 797 816 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 328 345 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 35 61 61 63 91 4b -- 797 816 10 58 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 15 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 329 345 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTGG 35 61 61 63 91 46 -5 797I 316 20 53 55 CCGAGCCCTTTGATGACTTC 8641 3471 15 591 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 330 3451 16 63 69 CATCCAGGCCCAGTGG 851 621 62 63 92 4/ 46 800 821 23 60 43 AGCCCmGATGACTTCCTGTTC 867 851 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 827 844 18 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 34 60 62 63 96 48 47 bo: 821 23 60 43 AGCCCTTTGATGACTTCCTSTTC 867 851 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 318 345 18 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 34 e: 62 63 96 49 48 300 821 23 60 43 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 851 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 329 345 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTGG 34 60 61 63 96 5C -3 795I 316 211 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 8641 3471 15 5s| 67 GGAGCGGGCTGTCTCAGA 32G aasl 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 851 6l| 62 69 93 bi s-: 796 816 21 59 51 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 864 847 18 59 67 GGAGCGGGCTGTCTCAfiA 820 336 17 69 53 TTCCCAGCATCATCCAG 35 61 62 69 98 \-J Design primem a sond Products > Real-Time PCR > Gene Expression A55ayiH Plates E_ Arrays > Assays > TaqMancIj; Gene Expression Assays TaqMan® Gene Expression Assays Click a tab below to learn mare about TaqMan Gene Expression Assays, To find and order assays, click the Search tab J.,,!,U,IM..,i,i,;.M As«, Search Product Description To begin. = elect a search method below - Keyword: Search by gene synVbof, gene nenne, public accession number, bia logice I protec s er molecular function. - Batch ID: Search by uploading a rile containing multiple assay IDs, RefSeq accession numbersr GenBank GI řsr LocusLink IDs gene symbols, IMAGE Clone» IDs, or species. M^^tn^r-^r^ r I All Text" 13 PH Disable wldcard search + Advanced Keyword Search Choose Specie? □ H, sapiens: Q A, thaliana [T] Amplic Fl R. norvsgicus ^ D. melanogaster [h] Amplic □ M. musculus □ C. elegans □ Amplic Q M. mulatta [Rhesus) [T] C. familiars (Canine) [Ť] Amplic O D- rerio [Zebrafish] O B. taurus {CoW) [T] G. gallus (Chicken) [Ť] O. cuniculus (Rabbit) O S. scrofa (Pig) Choose Set Membership @ Fitter by Amplicon Lengths length less than 70 length between 71 and 35 length behveen SS and 100 length greater than or equal to 10J www.appliedbiosystems.com SĚ1 Search All Assays [excludes Gene Copy Number Assays) Jj Search Gene Copy Number Assays. © Limit Assay Sets toi TARGET CLASS f\ Apoptosis Ö Fus __ ASSAY ATTRIBUTE [T] Ambion siRNA □ Endogenous Controls ^ - ■ ■ ■ □ 1700 r] 3' Most COLLABORATOR SETS £] Immune Tolerance fi- ,-■ i r\ Mammalian Gene Collection________ Product Description Literaturo/Support Your search foVc-Fos in All Text returned 27 results. ( Species: Homo sapiens Amplicori Length: ALL Set Membership: ALL ] If _ you wish to refirVyour search results by product availability, click a radio button below, and then click Filter Results. To filter your Í" Seartn HelP suits by other criteria, select from the categories list to the left of your results, Previous | 1 | Z | Next All Resul & Panther Classification: ■ Panthe Functio (Z&) ■ Panthe Process (26) Inventoried Assays. '■_' Made to- order Assays *' Inventoried and Made to order Assays Inventoried FCS D Assay ID 1. Assay ID Details: Hs00170S30_mL Alignme-nt Map si R N As & Related Products Symbol Name 'inventoried FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog AP-1 C-FOS NM 005252.2 m RNA 5 GenBank mRNAs Homo = apien = illipilCDIl Length 77 Design primem a sond Roche Applied Science *^ Czech Republic Login Quick Order Shopping Cart Help Contact Us Home Products Special Interest Sites Support S Resources News Special Interest Sites > Genomic Systems > Real-Time PCR Systems > Universa! ProbeLibrary System Universal ProbeLibrary ▼ Resr-i ime PCR Systems ► LightCycler5' Carousel-Based System ► LightCycler* 4ZQ System T Universal ProbeLibrary System > System Description ► Technology ► Assay Design Center > User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List > Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts www.universalprobelibrary.com Gene Expression Quantification with Real-Time PCR - Simple and Fast ♦ Design real-time qPCR assays online in seconds. * Rely on just 165 prevalidated pro&es for over five million qPCR assays for a large variety of organisms. + Reduce the cost of gene expression analysis by performing multiplex qPCR assays with Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays. Universal ProbeLibrary for Human Specify your target(s): -By sequence ID, gene name or keyword — e.g. ENST0ÜÜ00331789. NMJOHOI orX00351 or beta-actin Roche Applied Science Advanced primer3 settings -By sequence-------------------------------------------------------------------------------------------- e.g. >part cf XÜÜ351 Eluman mRNA fcr beta-actin CÄCGGCÄICGTcaccÄACIG^KiCGfiCÄTGeAGaaAaI^T33;accACÄCC^CT3ic^uu: GAGaGCGIGTGGCECCCGAGGAGCACCCCGTGaGaGACCGAGGCCCCCCIGAACCCC AAGGÖ^CCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATG lACGITGClATCCAGGCIGIGCIATCCCIGIACGCCIClGGCCGIACCACIGGCAICGTG ATGGACICCGGlGACGGGGlCACCCSlCAClGTGCCCAiraACGAGGGGlATGCCClCCCC 0 Automatically select an intron spanning assay. D Design multiplex PCRwith reference gene. Design primem a sond ▼ Real-lime PCR Systems ► LJghtCycler* Carousel-Based System ► LightCyclei-s 43D System ▼ Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology T Assay Design Center ► Pack Inserts ► Assay Design Guide ► Quick Reference ► Probe No. Conversion ► Need Help? ► User Statements anci Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Please choose the sequence(s) you would like to continue with. You can select up to 10 sequences. Name Length Description □ ENST00000400991.1 2669 □ ENST00000303Ě62.2 2103 □ ENST00000297904.2 2110 1732 1531 4343 2128 300 700 5672 n NM O03367.2 n NM 2072911 n NM 003131.2 n NM 004469.2 □ AB022275.1 □ AB022276.1 □ AB209128.1 □ AF126533.1 AL139130.28-201 Clone_Pased_ensemblJranscri Transcriptional activator of the c-fos promoter CR0C4 (CROC-4). [Source:UniprotiSPTREMBL:Acc:aSN964] FOS-201 HG^=-Protc-oncog fos)(G0JG1 [Source:Uni| FIGF-001 H( endothelial [c-fos-induc [Source:Uni| Homo sapie c-fos interac Homo sapie c-fos interac Homo sapie response el [SRF), mRN Homo sapie [vascular en m RNA Homo sapie partial cds Homo sapie partial cds Homo sapie [c-fos s e run transcription "I 238 Homo sapie ProheFinder has designed the optimal real-time PCR assay for: NM 0033S7.2 Homo sapiens upstream transcription factor 2, c-fos interacting (USF2J, transcript variant 1, m RNA. Assay details: Use Universal ProbeLibrary probe: #26, cat.no. 04687574001 Primer Length Position Tm %GC Sequence Left Primer 18 449 - 466 60 67 gtgacccaggtgggtgtg Right Primer 21 540 - 560 59 43 tgaagggattttggatcacag Amplicon (112 nt) gtgacccaggtgggtgtggacggggcagcccagcgcccgggccccgccgctgcctctgtg cccccaggtcctgcagcgcccttcccgctggctgtgatccaaaatcccttca | Download pack insert || PDF report || Text report || Order probes or set Transcript overview: 26 xn—r-nrrr 1732 Detailed view: 26 43y 441 570 Design primem a sond EnPSWai5?j^5m^ffi^^^^H ^^salPmbeU^ _^**^^^L. lí*»*«"----- V^ ^^^^^^^" ^L ^P*-^"" ^ ^A ^Jk LT^wl^iaUiTÍ- ^A ' ^M B w^ Shrnutí: - Rozumíte vlastnostem primem i základních typů sond a znáte faktory, které ovlivňují jejich hybridizaci a účinnost - Umíte navrhnout optimální sekvenci primem i hydrolyzační sondy pomocí dostupných programů a rozumíte parametrům designu EVROPSKÁ UNIE 5Sf ^řr A' MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, Op Vzdělávaní MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INI í INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR ú ě VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce G M O - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA- karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP a alelická diskriminace 4. High Resolution Melting Analysis 5. Kvantifikace množství (konkrétních) proteinů Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primem (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0|il Forward primer (10jiM) 2,0jliI Reverse primer (10jiM) 2,0jliI PCR grade H20 15,0|il Vzorek DNA nebo standard 5,0|il PCR 9540% - qRT-PCR - detekční limit 1 x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv. „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV- tulení PhHV) 23 Aplikace Aplikace v klinické virologu Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) Forward primer (10jiM) Reverse primer (10jiM) Sonda (20|Jvl) PCR grade H20 Vzorek DNA nebo standard Ster z nosohltanu Resupendovat ster v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu 1,0|il 5,0|il 1,0|il 2,0jliI 2,0jliI 0,2jliI 8,8jliI 5,0|il PCR öO'C 20min (Reverzní transkripce) 95^ 15min (Aktivace polymerázy) 95^ 15s ľ 45X ) 60^1 min \____/ Aplikace Terénní qRT-PCR - Detekce patogenu mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www. rapidcycler. com/GSA/index. htm I http://www.idahotec.com/BioDefense/ The Handheld Advanced Nucleic Acid Analyzer can detect tiolůgital palhogens in the leid. Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Single Nucleotide Polymorphism PubMed Nucleotide Protein Genome Structure PopSet Taxonomy OMIM Books SNP Search for SNP on NCBI Reference Assembly Search Entrez SNP Go Aplikace SNP genotypizace • Invader assay (Flap endonukleaza) • Denaturační gradientova gelová elektroforéza • Sekvenování • SNP microarray Invader assay in which probe complements the SNP resulting in fluroescene FEN cleavage site Quencher cleavage Invader assay in which probe mismatches at the SNP location preventing cleavage from occuring no FEN cleavage site no cl ea va ge and no fluorescence C4 ACTGACGACG Referenoe:Sasedon OifvSer M.2G05.The Invader assay for SNP genotyplng. PCR am pi ificatlon of I ocatio n of Na 0h wash a nd attach ment interest with blotlnytated prkner to streptavidin Hybridization of PCR product with an allele specific probe in the presences of a DNA duplex binding fluorescence molecule The tem perature at which the DNA hyb rid denatures and fluorescence is lost fs recorded and compared between assays with different probes Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, ohgonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridiziován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Tetra-primer based PCR pi DNA: G allele n DNA: A allele PCR product Not allele specific G allele specific A allele specific P3 A PJ ■G« •C C .A -A- -T- C' P4 P2 P4 P2 PCR Gel electrophoresis PCR product (;/r; homozygote G/A heterozygote A/A homozygote Nol allele specific ^^^m ^^^m ^^^m G allele specific ^^M i^^H A allele specific Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza Forward ^ mer- íc V Probe Allele l • Reverse Primer ý íí 111 n iw mO... rrr* Mismatch &m ■ Match ■é W&fs rm/rmTrr® mu. r*u t—r 1111111 Mitch Mismatch Legend Q Fluorescent Probe Q FSeponef 4ft FlLiCrtSMňt Ptflbe <6i?B^ Miner Groove Binder @ Quencher J Tarj ONA Potymerase Í Molecular Probe Target Sequence -t__f Emission of Fluorescence x Undetermined • Allele X • Allele Y • Both ■ NTC « -A ŕ 4 V . V 1- 2. * ■ £ ► ■:vŕ r 5" *■ ]£ K 1 ' Allele X [SNP Allele 1) Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě Výhody: Univerzální primery - Jediný fluorofor (SYBR Green) „High throughput" Aplikace: SNP, mutace - genotypizace Typizace mikroorganismů B. Normalized Melting Curves 100 ■u E * Single-stranded DNA (random coils) 76 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] I so 20 E I 0 I"" -'6 ® Wild types (t allele) ^V Mute (Tall ants Jr** J\ Ble) Heterozygote; 1 "NÍ ^v \t RTi R3 R3 •=< Rďi fi? V ^^ ^ .i^^^-^^ # Jř Heterozygotes 81 5 32 82.3 83 33.: 84 84.5 85 T(?riifj(Ta[ijriľ ("C) 80 BR 5 B7 Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA(3'UTR) Pre-iriiRNA genes Nucleus CytopíasFn loicflf ^ TT^rTTTTTininMA duple« i One strand incorporated inlo Rlz C Rlz C r % I j£nmr .....hui Turmx suppressor gene ÜL Tanjjel t mRNA" mfiNA cleavage Translalioii inhibition ;Tumor suppressor gene expression t Oncogene expression Aplikace miRNA detekce Specifický primer pro RT 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA (snRNA) 11 i.i.iiiiniiiii •j------------------ U18 U54 RNUS8B HY3 RMU5SA U75 — RPL21 -------U47 snoRNA735 snoRNA142 snoRNA202 -snoRNAIÍJ ■ 5110RNA251 E E E .11 Eh U U Iff j|jj|!!HÍ]i||«l"iiii]i líi ?! Human Tissues Mouse Tissue Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory m C + bisulfit = U mC intaktní C vs. C mC vs. C I STEPI] Sulphonation nh, Hsca OH H Cytosine sulphonate H» Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal 1 |STEP2| hfydrolytic Deamination H Uracil HS03- "oH. ,________, O^V^ ,^"sOa- | STE P aj ^n^ Alkali H Desulphonatjon Uracil sulphonate The two main components of the e p igen e tic code DNA methylation Methyl marks added to tertsin D NA bíSÉS re ř^eSS gene activity. Historie modification A combination of differerit molecules can attach io the '.tails' of proteins eel led histories. These alter the activity of the DNA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylovane cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primem nebo 2. Jsou použity ohgonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR 999 999 999 m_______ ft <& 9 sl^* :__222_____________ Aplikace ImunoPCR - Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce - Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou - Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay - Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR ELISA Coloured j IMMUNO-PCR product k___jĹ TMB substrate nm Protein Protein 777777777777777777777T. 777TT777f7T777777T777y: /s/ss*sŕs?šs/sss/ssŕff, a) Assemblage I b) Assemblage II c) Assemblage III Aplikace ImunoPCR u - U I o c = E E 14- 16- 18- 20- 22- t 24 26- ■ (^^B j 2.2 2.0 ■ 1.8 1.6 a 1.4 u c eg /■ 1.2 -E O 1.0 ^ 0.8 j to 0.6 - UJ 0.4 ■ 0.2 A A A i- r 0.0 I 1 1 ' 1 ' 1 1 ' l 5 6 7 8 9 10 11 log(molecules of PSA) Fig. 5. Real-time immuno-PCR (assemblage 11) (■) and ELISA (A) readouts of standard samples (logarithmic scale). Aplikace ImunoPCR - stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Human Pathulügy (200X) 39. 1474- 14K2 ELSEVIER Original contribution Human PATHOLOGY www.elsevier.com/loLatc/humpath Prostate-specific antigen mRNA and protein levels in laser microdissected cells of human prostate measured by real-time reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction and immuno-quantitative polymerase chain reaction Pamela Pinzani PhDa, Kristina Lind PhDbd, Francesca Malentaccfri GabrieLLa Nesi MDC, Francesca Salvianti PhDa, Donata Villari MDf, MikaeL Kubista PhDde, Mario PazzagLi PhDa, Claudio Orlando PhDaJ ? Ö • . ' 4" t a i —i--------1--------1--------1--------1--------1--------r~ N1 N2 N3 N4 145 N6 N7 iodooooo- R« O.BBO: p<0.001 ♦ soaoooo- ♦ ♦ ♦/ 6COOOO0- s 4DOO0O0- ♦ ♦ 20OOOOO- ****** a- V IWdOn 2WWfl 30J0DPP 'MOW 3OTW WdDOD PSAPrat«ih(tnDl«cultirccll) Aplikace Amplifikace DNA bez PCR? Helicase-dependent isothermal DNA amplification 1. dsDNA je denaturovaná pomocí helikáz a SSB proteinů 2. Primery hybridizují ke komplemntární sekvenci 3. Polymeraza doplní ssDNA na dsDNA, která slouží jako substrát helikázám Z) .1. I 1) n x 2_ 25D •■ 200 ■■ 150 100 ■■ 50 ■■ o ■■ -50 r \f y ľ A J^y 2 ■ ■ // // jy T. '■-;*-___________________________________________________________________ \ ■■ ---------\—I—I—1—i—(—1—1—1—1— i—i 1—1 1— 1—1 1—1 1-----1 1-----1 \-----1 -----1-----1-----1 10 20 30 40 50 60 70 BO 90 100 110 Time (min) Helicases unwind DNA duplexes in the presence of SSB and accessory protein 3- %__4 .S V., Primers anneal to ssONA VL^ H 5' DNA polymerases extend the primers: one duplex is amplified to two duplexes -H cisDNA are separated by helicases and this chain reaction repeats itself Aplikace Po dnešní přednášce: - Máte představu o základních aplikacích qRT-PCR - genová exprese, SNP, analýza miRNA, High resolution melting analysis, ImmunoPCR EVROPSKÁ UNIE 5Sf ^řr A' MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, Op Vzdělávaní MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INI í INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR Delta Rnvs Cycle o< A 2 3 4 5 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34- 35 36 37 38 39 VII. Troubleshooting Problémy v qRT-PCR analýze Jak vypadá správný amplifikační výstup? r t 1fl n- V- L I O ! ^ -^ 18,04 á / 7 / ComDonent 200K 160K U 12QK 8DK 40 K 1 3 R 7 B 11 13 "I Fi M 13 31 33 ?P 37 ?P 31 í T Tfi 37 ?S\ Duplikátní reakce • Exponenciální amplifikace • Identická amplifikace • Podobné/shodné Ct • Odpovídající fluorescence jednotlivých reportérů Problémy v qRT-PCR analýze Problém 1: Příliš mnoho templátu • Vysoká hodnota pozadí • Fluorescence v prvních cyklech (ze kterých se počítá baseline) je vyšší, než fluorescence na konci reakce Řešení: • Ředit templát 1:100 - 1:1000 a zopakovat PCR • Změnit manuálně treshold nebo nastavení baseline iäLä—.. Baseline 3.-25. cyklus ine 3.-13 cyk ,.,-_ . ' é t '/ ^ ^ \ / i *í i ,,,.,. 7 ,.,.„„„,.„,.„ . „ „ „ „ „ ,. * „ „ „ „ „ „ „ „ „ . , ,-, „ „ « Problémy v qRT-PCR analýze Problém 2: Amiifikace není exponenciální Pravděpodobně přítomnost inhibitorů v konkrétním vzorku Řešení: Ředění templatu 1:10-100 Uelta Kn vs Uy;lt Well A10 A10 A12 A12 B10 B10 B12 B12 C10 C10 C12 C12 D1Q D1Q D12 D12 E10 E10 E12 E12 F10 F10 F12 17.46 21.97 1E-.SE 13.2c ?&.?- Undet. 37. S6 Undet. 17.18 2c.:e 1c.C7 13.1c Undet. Undet. Undet. Undet. 1c. is 21.55 15.71 20.11 16.75 i?.s: Undet. 37,86-38,64 Undetermined" Problémy v qRT-PCR analýze Problém 3: Ct duplikátních reakcí se výrazně liší • pravděpodobně nedošlo k amplifikaci • gelová elektroforéza PCR reakcí nebo • multikomponentní záznam fluorescence • nepřesné pipetování, Monte Carlo efekt, přítomnost inhibitoru v reakci Řešení: • Zopakovat reakce nebo (pokud už nemáme vzorky) • vzít v úvahu Ct z exponenciální reakce • přijít na příčinu problému (otestovat příslušnou jamku v bloku, reagencie atd.) ^^"" / J^^ JMkáLl y j Buplikát 2 7 s Sk ^ FrAKTcnjjDlí-cát 1 Z /* / / / —■"'' ĽAll/l r\t vA\\.,W O r- - r AM d Lipli Kal z 11 'x1' ' ' ' ' ' ' ' ' ' IH"Ť1TI ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ^^ Problémy v qRT-PCR analýze Problém 4: Nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku Řešení: • Zopakovat reakce včetně pozitivní kontroly • Pokud opět nedošlo k amplifikaci u žádného vzorku, zkontrolovat společné chemikálie (voda, master mix, sonda) • Zkontrolovat reakci na agarózovém gelu a vyloučit selhání sondy, eventuálně provést reakci spolu se SYBR green • Pokud se problém vyskytuje pouze u některých vzoků je problém s těmito vzorky (kvalita templátu, inhibice) Rn>ísCvcle 1.64 1.24 1.04 — Problémy v qRT-PCR analýze Problém 5: Nefunguje sonda Řešení: • Vyloučit lidskou chybu, přítomnost inhibitorů, nekvalitní templát, chyby vRT • Kontrola pomocí SYBR Green nebo v agarózovém gelu • Pokud je vyloučeno selhání amplifikace, provést test s DNázou I DNázal - oddělí fluorofor od zhášeče a umožní fluorescenci - problémy ve značení nebo purifikaci sondy i . #>^Labeled probe after DNase I digest Z i E o o O tu O ľ3 Poor v R2 = D QQ3A X K K, i i i i i i 1,4 1,6 1,8 2,2 2,4 2,6 Problémy v qRT-PCR analýze Problém 7: Směrnice kalibrační křivky je větší než -3,3 • Účinnost PCR vyšší než 100% • V případě specifické detekce (TaqMan) většinou pipetovací chyby nebo chyby ředění - event, změnit některé parametry analýzy (zejména baseline) • SYBR Green - možné nespecifické produkty (primer dimery) Řešení: • nová reakce • optimalizace PCR o Amp3 ic*bon ŕŕílwncjŕ cakutd« Sfaŕe: CfoienotXt j l ľa t) R" =0.976 Sl0pe=-2.244 . Initial quantity (relative) - - o> o c (D Ü 2? o 3 . UL m —_—. 68 74 80 86 92 Temperature °C Problémy v qRT-PCR analýze Problém 8: Nelze naŕedit standardy na nižší koncentraci • Přítomnost kontaminující DNA Řešení: • nové standardy • ověřit čistotu RNA vstupující do procesu Cycle # Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají divně • příliš mnoho templátu • chybné nastavení baseline Řešení: • n a ředit vzorky • změnit nastavení baseline - vyloučit cykly, ve kterých je abnormální fluorescence • změnit algoritmus výpočtu Cycle # Problémy v qRT-PCR analýze Problém 9: Amplifikační grafy vypadají divně • změnit algoritmus výpočtu - tzv. adaptivní nastavení baseline - pro každý cyklus jednotlivě ||HJ.....mil Cycle # Problémy v qRT-PCR analýze Shrnutí: • Jak má vypadat správný průběh real-time PCR? • Jak nemají vypadat výstupy? • Kdy nevěřit svým datům a jak je ověřit? • Jak vyřešit některé běžné problémy s amplifikací? Cvičení: 4.1.-7.1.2010 (PetrVaňhara) 11.1. -14.1. 2010 (Sabina Sevčíková) 18.1.-21.1.2010 (Zdeněk Ručka) Test: Na konci cvičení (7.1., 14.1,21.1.2010) Výběr možností (vždy 1 správná) + příklady Min. 75%