Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 3 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Principy průtokové cytometrie a sortrování n sorting n zpracování signálu n analýza dat n kompenzace signálu Creation of a Voltage Pulse Height, Area, and Width Signal processing Lineární a logaritmický obvod n lineární n logaritmický n dynamický rozsah n kompenzace fluorescenčního signálu Lineární obvody n výstupní signál odpovídá (poměrově) vstupnímu signálu n detekce signálu založeného na kvantitativním vztahu (DNA značení) vyžaduje 10 bitové rozlišení n vyšší přesnost vyžaduje vyšší množství bitů n současná zařízení mají rozlišení 4 řádů v logaritmické škále - ADC musí mít schopnost rozlišení nejméně 1/10,000 což odpovídá 1 mV v 0-10 V škále. n pro dosažení této přesnosti je nutné 14ti bitové rozlišení AD převodníky Proč používat lineární obvody? n Kompenzace signálu musí být prováděny na lineárních datech. Tzn. že celá elektronika musí být lineární (> 14-ti bit ADC) nebo musí být doplněn speciální obvod mezi předzesilovač a display. n Pro imunologické fenotypizace potřebujeme velký dynamický rozsah. n průtokový cytometr zesiluje signál na hodnoty mezi 0-10 V před ADC. Kolik bitů? n Pokud konvertujeme analogový signál pomocí 8 bitového ADC – máme 256 kanálů (2^8=256) odpovídajících rozsahu 0-10 V n Rozdíl mezi kanály je 10/256=~40mV Ideální logaritmický zesilovač Kde je nepřesnost? n Předpokládejme že pracujeme se 14-ti bitovými daty (16,384 kanálů). n Nejmenší rozlišení na 0-10V škále bude 610 mV. n Prvních 10mV škály je reprezentováno kanály 1-16. n Tomu je možné předejít např. digitalizací v 16-ti bitech (65,536 kanálů) Logaritmické zesílení & dynamický rozsah „Ratio circuits“ n jsou analogové obvody generující výstupní signál odpovídající poměru ze dvou vstupních signálu (dvou detektorů) n Tvořeno speciálními moduly tzv. analogové násobiče. n např. pro výpočet povrchové denzity navázaných antigenů dělíme počet navázaných molekul velikostí povrchu buněk (není běžné) n Detekce intracelulárního pH n Detekce intracelulárních Ca^2+ (Indo-1) n lze také kalkulovat pomocí speciálních softwarových nástrojů Kompenzace fluorescenčního signálu …později n přesnost – koeficient variance (CV) n citlivost, šum, pozadí n MESF jednotky n Přesnost a linearita Koeficient variance Kvantitativní jednotky - ABC Antibody Binding Capacity n množství protilátky, které se specificky váže na populaci buněk (nebo mikročástic) n pozn.: Hodnota ABC nemusí odpovídat skutečnému množství antigenů na povrchu buněk nebo částic Určení ABC Proč je důležité určit práh? n určuje nejnižší množství značky (protilátky) detekovatelné přístrojem n určí, zda pozadí (šum) interferuje s analýzou MEFS Units n Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome (MESF) Units – metoda pro určení citlivosti přístroje (Abraham Schwartz) – směs částic označených známým množstvím molekul fluorescenční značky – práh určený pomocí MESF znamená nejmenší detekovatelné množství fluorochromu (BD FACS Aria 125 MEFS – FITC) Linearita detekce n praktický příklad nelinearity může být během měření množství DNA v buňkách v G0/G1 a G2/M fázi buněčného cyklu n lze použít mikročástice nebo jiné vnitřní standardy pro kalibraci Analýza dat n Zobrazení dat – histogram – dot plot – isometric display – contour plot – chromatic (color) plots – 3 D projection n Gating Způsoby pro zobrazení dat Histogram distribuce četnosti n Histogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr n Jednoduchý výstup n Nekorelujeme s dalším parametrem n Problém s identifikací populací Dot plot n Zobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů n Jednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice) n Hodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě n Nemáme informaci o relativní denzitě částic n Problémy s vykreslením v případě velkých objemů dat Density & contour plot Density plot: n Zobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti n barva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic Contour plot: n spojnice spojuje body (částice) se stejnou hodnotou signálu n V podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je frekvence Čas jako jeden z parametrů 3D zobrazení n 2 parametry + četnost n 3 parametry společně 3 Color Combinations 3 Color Combinations „Gating“ Real-Time vs. Software Gating Určení regionů Region vs. gate Statistika n Aritmerický průměr n Geometrický průměr n Medián – odhad střední hodnoty – není ovlivněn extrémními hodnotami n Směrodatná odchylka n Koeficient variance n Modus – nejčastější hodnota Statistika pro histogram Analýza kvadrantů Logický „Gating“ (Booleova logika) Boolean Gating Boolean Gating Boolean Gating Boolean Gating Back Gating Back Gating Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… Způsoby pomocí kterých lze upravit výsledky: Co je problém při vícebarevné detekci? Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci Kompenzace fluorescenčního signálu Kompenzace fluorescenčního signálu Kompenzace fluorescenčního signálu Nastavení kompenzací Kompenzace - literatura Mario Roederer - Compensation in Flow Cytometry Current Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 John Wiley & Sons, Inc. M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem. Cytochem. 25:899-907. M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7:558-565. S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8:114-119. C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the New York Academy of Sciences, 677:167-184. Shrnutí přednášky n Sorting n zpracování signálu n vizualizace dat a „gating“ n kompenzace