Bi9393 Analytická cytometrie Lekce 4 Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Biologické aplikace průtokové cytometrie n analýza DNA n analýza buněčných funkcí n fluorescenční proteiny Co je důležité při přípravě vzorku a značení… n Postup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit – závisí na typu buněk a konkrétní analýze – suspenze jednotlivých buněk – vitální značení – fixace (etanol, formaldehyd) – permeabilizace (detergenty) – difúze – aktivní transport Analýza histogramu buněčného cyklu n nepoužívá se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu n je nutné používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází Analýza ploidity u vyšších rostlin Analýza DNA a RNA Pyronin Y vs. Hoechst 33342 - Pyronin interaguje s ds RNA a DNA ale jeho vazba na DNA je inhibována přítomností Hoechst 33342 n Acridine orange - při interakci s RNA emituje červené světlo a při interakci s DNA zelené Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA Detekce mitotických buněk n Histone H3 je specificky fosforylován během mitózy n dvojité značení DNA vs. H3-P identifikuje populaci buněk v M-fázi Analýza buněčných funkcí n Průtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou analýzu vitálních buněk Detekce viability n jedna z nejjednodušších analýz n funguje na principu: – detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM n ethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat n Pomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci Detekce viability Detekce intracelulárního pH n Fluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH n SNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH n Nutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce počtu buněčného dělení n Nespecifické fluorescenční označení proteinů pomocí carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE nebo CFSE) Detekce počtu buněčného dělení Detekce reaktivních kyslíkových skupin n Reaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů – posttranslační modifikace proteinů – regulace transkripce – regulace struktury chromatinu – přenos signálu – funkce imunitního systému – fyzický a metabolický stres – neurodegenerace, stárnutí Potential sites of intervention Hydroethidine The Nobel Prize in Chemistry 2008 n "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Fluorescenční proteiny n bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca^2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Fluorescenční proteiny n Osamu Shimomura – 1961 objevil GFP a aequorin Science. 1994 Feb 11;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. n A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny in vivo molekulární vizualizace Fluorescenční proteiny n Sergey A. Lukyanov – Objevil „GFP-like“ proteiny u nesvětélkujících korálů Roger Tsien n ~ 2002 – mutace FP = barevné spektrum http://www.tsienlab.ucsd.edu/ in vivo molekulární vizualizace in vivo molekulární vizualizace biarsenical–tetracysteine system n Nefluorescenční, membránově permeabilní biarsénová značka vytváří kovalentní fluorescenční komplex s jakýmkoliv intracelulárním proteinem obsahujícím krátký tetracysteinový motiv (CCPGCC) „High Throughput Flow Cytometry“ n automatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) n využití principu vícebarevné analýzy Automatizované systémy měření vzorků Automatizovaný „microsampler“ systém Biologické aplikace průtokové cytometrie n Cytogenetika – analýza chromozómů • karyotyp • sortrování – chromozómové DNA knihovny – FISH značení (chromosome painting) Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů n synchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) n izolace chromozómů n značení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin = celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti Analýza a sortrování chromozómů „Flow karyotype“ Sortrování chromozómů Sortrování chromozómů Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii n ekologie n potravinářství n bioterorismus Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii n viabilita n metabolické funkce n sortrování n analýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii n Sortrování – EPICS + Autoclone® modul Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps) Průtoková cytometrie kvasinek n buněčné dělení n viabilita n membránový potenciál n respirace n produkce H[2]O[2] n citlivost k antibiotikům n separace Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii n studium pico- a nano-fytoplanktonu (< 20 mM) n analýza metabolických funkcí planktonu n studium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii n analýza DNA Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie bezobratlých n lze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky n Příklady aplikací: – buněčný cyklus – cytotoxicita – apoptóza Invertebrate Survival Journal Shrnutí přednášky n analýza DNA n analýza buněčných funkcí n fluorescenční proteiny n Flow cytometrické metody detekce apoptózy. n „High-throughput“ průtoková cytometrie … n … a uplatnění vícebarevné detekce. n sortrování chromozómů n aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých