IEF 1 IIzzoelektrickoelektrickáá fokusacefokusace K. Šlais 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 22//6060 IzoelektrickIzoelektrickáá fokusacefokusace -- IEFIEF elektromigraelektromigraččnníí separaseparaččnníí analytickanalytickáá metodametoda vyuvyužžíívajvajííccíí existenceexistence izoelektrickizoelektrickééhoho stavustavu amfolytamfolytůů,, kdykdy efektivnefektivníí nnáábojboj jeje nulovýnulový.. pHpH == pIpI AnalytyAnalyty -- proteinyproteiny SeparaceSeparace -- pIpI < 0.01< 0.01 FokusaceFokusace ­­ zakoncentrovzakoncentrováánníí CharakterizaceCharakterizace -- pIpI 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 33//6060 ProteinProtein jakojako amfolytamfolyt 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 44//6060 BiprotickýBiprotický amfolytamfolyt pI = (pK1 + pK2 )/2 [-dz/d(pH)]pI pK 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 55//6060 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 66//6060 Vznik pH gradientuVznik pH gradientu IEF 2 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 77//6060 Druhy IEFDruhy IEF GelovGelováá IEFIEF ­­ SS nosnýminosnými amfolytyamfolyty S imobilizovaným gradientem (IPG)S imobilizovaným gradientem (IPG) DvourozmDvourozměěrnrnáá elektroforelektroforééza 2D = IEF + SDS PAGEza 2D = IEF + SDS PAGE KapilKapiláárnrníí IEFIEF PreparativnPreparativníí IEFIEF FreeFree flowflow KomorovKomorováá ( nap( napřř.. RotoforRotofor)) 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 88//6060 Struktura geluStruktura gelu agarosa polyakrylamid 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 99//6060 VariantyVarianty gelovgelovéé IEFIEF InstrumentaceInstrumentace (1)(1) outerouter chamberchamber, (2) CCD, (2) CCD cameracamera, (3), (3) graphitegraphite electrodeselectrodes, 50 mm, 50 mm distancedistance betweenbetween contactcontact pointspoints, (4), (4) glassglass plate, (5) polyacrylamideplate, (5) polyacrylamide gelgel ofof sizesize 125 x 54 x 0.4 mm.125 x 54 x 0.4 mm. 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1111//6060 VerticalVertical gelgel IEFIEF 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1212//6060 Typický výsledekTypický výsledek gelovgelovéé IEFIEF IEF 3 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1313//6060 StaStandardyndardy pIpI -- proteinyproteiny nestabilní, nečisté, drahé, málo barevné, málo rozpustné při pI 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1414//6060 NNíízkomolekulzkomolekuláárnrníí barevnbarevnéé pIpI markerymarkery PPoožžadavky na pIadavky na pI markerymarkery -- ŠŠkkáála pIla pI odod ~ 2 do 11,~ 2 do 11, popo ~ 0.5 pI~ 0.5 pI -- dobrdobréé amfolytyamfolyty,, --dz/dpHdz/dpH ~0.5 > 0.05,~0.5 > 0.05, pKpK ~2 < 4~2 < 4 -- rozpustnostrozpustnost veve vodvoděě ppřřii pH = pI, > 1 mg/mlpH = pI, > 1 mg/ml -- rrůůznznéé barvybarvy,, maxmax > 400 A> 400 A1%1% > 100> 100 -- ČČistotaistota, > 99 % ,, > 99 % , -- DostupnostDostupnost,, cenacena markerumarkeru -- StabilitaStabilita -- hydrolýzahydrolýza,, oxidaceoxidace,, fotodegradacefotodegradace,, mikroorganismymikroorganismy 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1515//6060 Aminomethylované nitrofenoly 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1616//6060 ŽŽlutlutéé pI markerpI markeryy 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1717//6060 ? Barevné pI markery ? 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1818//6060 ChemieChemie -- ŠŠkkáála pIla pI odod 2 do 112 do 11 -- dobrdobréé amfolyty,amfolyty,pK~2<4pK~2<4 -- rozpustnostrozpustnost > 1 mg/ml> 1 mg/ml -- rrůůznznéé barvybarvy -- ČČistotaistota -- Dostupnost, cenaDostupnost, cena -- StabilitaStabilita hydrolýza,hydrolýza, oxidace,oxidace, fotodegradacefotodegradace,, mikroorganismymikroorganismy separaseparaččnníí prostprostřřededíí dithiothreitoldithiothreitol,, nízkomolekulární barevné pI markery IEF 4 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 1919//6060 Příklad barevného pI markeru 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2020//6060 pK1 = 3.50 0.02 pK2 = 5.92 0.02 pI = 4.71 0.02 Spektrofotometrické určení pI N N N N Me Me HO2 C 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2121//6060 UrUrččeneníí pI interpolacpI interpolacíí vv gelovgelovéé IEFIEF Gradient pGradient pHH SmSměěs 30 jednoduchýchs 30 jednoduchých pufrpufrůů BiolytBiolyt 33 ­­ 1010 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2222//6060 Dynamika pH gradientuDynamika pH gradientu BiolytBiolyt 33--1010 LineLineáárnrníí gradientgradient pH 4pH 4 -- 1010 Po hod malé změny pH gradientu 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2323//6060 Vývoj fluorescenčních pI markerů Vis fluorescence ief446_INDEX.exe 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2424//6060 in Clinical Proteomics. From Diagnosis to Therapy. J. Van Eyk and M.J. Dunn (Eds.), Chapter 2, Protein Separation by Two-Dimensional Electrophoresis Pamela M. Donoghue, Miroslava Stastna, Michael J. Dunn, p 13, 2007 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim colored markers Immobiline Dry Strip (Amersham Biosciences) pH 3­10, 18 cm. Apparatus: Protean IEF Cell (BioRad). Sample: 10 ml of pI markers mixture diluted with 340ml of IEF buffer (8M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 0.01% bromophenol blue, 1.5% (v/v) hydroxyethyl disulfide, 0.2% (v/v) IPG buffer pH 3­10). The acidic end is on the left and the basic end on the right side of the strip. The pI values of individual pI markers are marked in the picture IEF of mixture of chosen pI markers in the first dimension strip of 2D gel electrophoresis IEF 5 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2525//6060 pI 4.3 ­ oranžová 3 g pI 5.3 ­ levandulová 3 g pI 5.7 ­ žlutá 5 g pI 6.2 ­ červená 3 g pI 3.3 ­ červená 1 g pI 4.3 ­ oranžová 3 g pI 5.3 ­ levandulová 3 g pI 5.7 ­ žlutá 5 g pI 6.2 ­ červená 3 g pI 7.6 ­ červená 3 g pI 9.0 ­ žlutá 5 g 7 cm IPG strip pH 4-7 7 cm IPG strip pH 3-10 NL 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2626//6060 2D Gel2D Gel electrophoresiselectrophoresis SDS PAGE IEF 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2727//6060 2D2D -- typicaltypical resultresult ­­ silversilver stainingstaining 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2828//6060 2D Gel2D Gel electrophoresiselectrophoresis -- SoftwareSoftware 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 2929//6060 ProteinProtein identificationidentification byby 2D gel2D gel electrophoresiselectrophoresis --MSMS 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3030//6060 LOWLOW--MOLECULAR MASS PI MARKERS INMOLECULAR MASS PI MARKERS IN COMBINATION OF GEL IEF WITH MALDICOMBINATION OF GEL IEF WITH MALDI--TOF MSTOF MS pI markers 10.1 9.3 8.4 7.5 6.4 5.3 3.9 Cytochrome C Myoglobin Albumin ­ amylase 2l 4l pI 3.9 5.3 6.4 7.5 8.4 9.3 10. 1 313.07 297.08 315.07 271.05 272.06 303.02 371.11265.18 255.06 305.03 309.18 268.09 284.08 270.08 285.09 260.82292.81 336.16 320.16 265.08 394.9 316.88300.91 318.88 378.93 266.15 358.15 272.96 385.10 371.11 340.71329.39281.02 294.15 280 310340 370400 Mass (m/z) 332.21 371.13272.97 343.29 348.96385.13 315.05281.03 250 362.27 IEF 6 Use of coloured pI - markers to determine the slope of the pH gradient and the position where to ,cut` and remove the individual Sephadex fractions in order to fit to the corresponding narrow pH range IPGs Courtesy of Carsten Lück Methods in Molecular Biology, vol. 424: Volume 1: Sample Preparation and PreFractionation, Edited by: A. Posch , Chapter 22, Sample Prefractionation in Granulated Sephadex IEF Gels Angelika Görg, Carsten Lück, and Walter Weiss, p 277, Humana Press Inc., 2007, Totowa, NJ IEF in Granulated Sephadex Gels 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3232//6060 pIpI markersmarkers -- LMLM ladderladder Home madeHome made stripstrip,, linearlinear gradientgradient pHpH 44--10,10, 11cm,11cm, 1 min 30V,1 min 30V, 50 min 30V50 min 30V --> 3500V,> 3500V, 2 ho2 hoursurs 3500V.3500V. IEF in Sephadex gels and IPG strips Hodný Z., Přidalová J., Institute of Experimental Medicine AV ČR, v.v.i., Prague Courtesy of Z. Hodný Courtesy of J. Přidalová 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3333//6060 KapilKapiláárnrníí IEFIEF 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3434//6060 KapilKapiláárnrníí IEF standardIEF standardůů proteiny pI markery 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3535//6060 Kapilární IEF s DAD detekcí 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3636//6060 CIEFCIEF pH 3 - 10 Horká, M., Růžička, F., Horký, J., Holá, V., Šlais, K. Anal. Chem., 78 2006 8438-8444 Capillary isoelectric focusing and fluorometric detection of proteins and microorganisms dynamically modified by poly(ethylene glycol) pyrenebutanoate CH2 CH2 CH2 CO(C2 H4 O)9 OH Monomer Excimer IEF 7 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3737//6060 Mikroorganismy, význam = výrobní prostředek v biotechnologiích koloběh látek, symbiotické organismy Patogenní mikroorganismus = živé biologické agens schopné vyvolat masové infekční onemocnění nebo otravu lidí, zvířat či rostlin . Mikroorganismy (MO) = bakterie, kvasinky, viry, paraziti Normální flóra každého jedince = bakterie, event. plísně, ale nikdynikdy viry. 16.stol. - mor Robert Koch (1843 -1908) Mycobacterium tuberculosis 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3838//6060 CIEF miCIEF mikkroorganismroorganismůů SampleSample:: E.E. colicoli, C., C. albicansalbicans, S., S. epidermidisepidermidis, E., E. faecalisfaecalis inin physiologicalphysiological salinesaline solutionsolution, 4 x 10, 4 x 1088 cell mlcell ml--11.. 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 3939//6060 280 nm, pH gradient 2 - 5 2 C 1 C. tropicalis E. coli S. epidermidis S. aureus Yeast cell 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4040//6060 CIEF virů s UV detekcí 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4141//6060 MicrofluidicMicrofluidic FreeFree--Flow ElectrophoresisFlow Electrophoresis for Proteomics on a chipfor Proteomics on a chip The miniaturization of FFE implies several advantages especially considering sample volume and separation speed. In contrast to the tens of milliliters of sample consumed by conventional large scale FFE devices, microfluidic FFE systems require only tens of nanoliters up to hundreds of microliters of sample. This is especially interesting in clinical analysis where often only low sample volumes are available. Furthermore, instead of residence times of up to tens of minutes, microfluidic FFE (-FFE) devices separate within several seconds. 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4242//6060 Figure 4 Free-flow isoelectric focusing of 7 fluorescent IEF markers: (a) Photograph shows the device, when no voltage was applied. The white numbers directly correspond to the stream numbers given in Figure 2. (b) When 150 V (I = 50 A) was applied, the markers (pI 4, 5.1, 6.2, 7.2, 8.1, 9, and 10.3) fully separated within less than 2 s. The sample flow rate was 0.4 L min-1 (v = 2 mm s-1) The apparent kinks in the fluorescent tracer paths are caused by merging multiple photographs. Published in: Dietrich Kohlheyer; Jan C. T. Eijkel; Stefan Schlautmann; Albert van den Berg; Richard B. M. Schasfoort; Anal. Chem. 2007, 79, 8190-8198. DOI: 10.1021/ac071419b Copyright 2007 American Chemical Society IEF 8 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4343//6060 PreparativnPreparativníí IEF proteinIEF proteinůů 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4444//6060 Preparativní autofokusace peptidů pI = 5.3pI = 3.9 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4545//6060 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4646//6060 rotofor FF IEF 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4747//6060 Copyright 2006 American Society for Biochemistry and Molecular Biology Horth, P. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5: 1968-1974 Schematic presentation of the setup used for OFFGEL electrophoresis 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 4848//6060 IEF 9 Use of pI-dye markers as on-line trackers for the focusing of peptides during electrophoresis on the OFFGEL fractionator device (OGE). Heller, M. DKF, University of Bern, Switzerland ˇpI-marker dyes were added at 10 ug (dark orange, pI 3.9; violet, pI 5.2; red, pI 6.2; bright orange, pI 8.0) or 30 ug (yellow, pI 10.1), respectively. ˇPeptide/dye solution was distributed into the 13 wells of the OGE. ˇIPG strips pH 3-10 from BioRad re-hydrated in OGE buffer were used. ˇFocusing was done by setting a maximal potential (1250 or 1500 V) and a current limit of 50 uA. Courtesy of M. Heller 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5050//6060 Preparativní free flow IEF 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5151//6060 ZZáákladnkladníí ideaidea FluidikaFluidika ­­ kkontinuontinuáálnlníí rozrozššiiřřovováánníí plochplochéého kanho kanáálu plu přři toku kapalinyi toku kapaliny od vstupu k výstupu pod vstupu k výstupu přřii ččememžž je generovje generováán rozbn rozbííhavý tokhavý tok a soua souččasnasněě,, IEFIEF -- malmaléé ppřřííččnnéé napnapěěttíí na vstupu kanna vstupu kanáálu alu a vysokvysokéé ppřřííččnnéé napnapěěttíí na výstupu kanna výstupu kanáálulu IEF v rozbíhavém toku (divergent flow IEF, DF IEF) 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5252//6060 ++ -- vysoká nízká Separované frakce nosné amfolyty & analyty anolyt katolyt vysoká rychlost toku malé napětí krátká separační dráha rychlá separace Fluidika ­ rozbíhavý tok IEF ­ řízení elektrického proudu vodivostí kapaliny Jednoduché zařízení: Membrány eliminovány použitím porézního lože Separační plocha a vstupy a výstupy kapaliny tvořeny netkanou textilií Kontakty k elektrodám tvořeny netkanou textilií Tok generovaný hydrostaticky IEF v rozbíhavém toku vysoké napětí Účinná fokusace 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5353//6060 DivergentDivergent flowflow IEFIEF The polypropylene nonwoven web 0.1 mm thick lies on white polyvinylchloride flexible sheet input strips dipped in Petri dishes containing: above left ­ anolyte above middle - solution of carriers and pI markers above right ­ catholyte middle left - carbon rod anode middle right ­ carbon rod cathode output strips - bottom - microplate Streamlines of red pI markers from left pI = 3.3, 4.7, 6.2, 7.6, 11.0 Flow due to hydrostatics and capillary elevation Constant power load 1 W No cooling K. Slais Electrophoresis 2008 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5454//6060 DynamicsDynamics ofof divergentdivergent flowflow IEFIEF 1 W constant power load switched off at 11 hod 30 min switched on at 11 hod 40 min Flow inputs: Anolyte: 0.05 M H3PO4 , 5.2 mS/cm,1 mL/h Catholyte: 0.05 M NaOH, 11mS/cm, 1 mL/h Carriers and pI markers: 0.75 mS/cm, 4 mL/h, Holdup volume: 1 ml Separation area: 71 cm2 Streamlines of red pI markers from left pI = 3.3, 4.7, 6.2, 7.6, 11.0 K. Slais Electrophoresis 2008 IEF 10 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5555//6060 IEF v rovnoběžném toku Materiál separačního prostoru, délka 15 cm, výstupní šířka 8 cm, výkon 1 W Pracovní roztoky Výstupní tok 6 mL/h = 0.9 cm/min jsou stejné u obou geometrií 730 V 380 V IEF v rozbíhavém toku Šlais K. Electrophoresis 29 2008 2451-2457 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5656//6060 Linie červených pI markerů a proteinů od leva oranžová - methyl oranž, levandulová - marker pI 5.2 červená ­ marker pI 6.2 hnědá ­ hemoglobin, 0.5 mg/ml cihlová ­ cytochrom C, 0.5 mg/ml fialová ­ marker pI 11 Vstupní roztok s pI markery a proteiny má vodivost 1.05 mS.cm-1. průtok 0.18 mL.min-1 VstupnVstupníí elektrodyelektrody ­­ 75 V, 1.575 V, 1.5 mAmA VýstupnVýstupníí elektrodyelektrody ­­ 380 V, 1.380 V, 1. mAmA IEF v rozbíhavém toku s jedním vstupem Šťastná M., Šlais K., Electrophoresis, přijato -00293 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5757//6060 time stability 0 50 100 150 200 250 300 0 2 4 6 8 10 12 14 16 time [hours] position[pixels] MO pI 5.2 hemoglobin cytochrom C Časová stabilita polohy linií Kolísání linií 3.96 %, 3.94 %, 1.26 % a 1.88 % IEF v rozbíhavém toku s jedním vstupem Šťastná M., Šlais K., Electrophoresis, přijato -00293 Linie od leva oranžová - methyl oranž, levandulová - marker pI 5.2 hnědá ­ hemoglobin, 0.5 mg/ml, cihlová ­ cytochrom C, 0.5 mg/ml, průtok 0.18 mL.min-1 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5858//6060 PouPoužžititíí barevných pIbarevných pI markermarkerůů ppřři preparativni preparativníí SI DF IEFSI DF IEF aplikovanaplikovanéé na extrakt jena extrakt ječčmenemene Kontinuálně dávkované pI markery: oranžová - MO, fialová - marker pI 11 VstupVstup -- Extrakt jeExtrakt ječčmene (neodsolený) +mene (neodsolený) + pufrypufry + MO ++ MO + markermarker pI 11pI 11 prprůůtoktok -- 0.23 ml/ min,0.23 ml/ min, vodivostvodivost -- 1.01.0 mSmS/cm/cm VstupnVstupníí elektrody: 4elektrody: 4 mAmA, 20 V, 20 V VýstupnVýstupníí elektrody: 6elektrody: 6 mAmA, 800 V, 800 V 1 kapka roztoku sm1 kapka roztoku směěsi pIsi pI markermarkerůů LMLM Mazanec K.,Mazanec K., BobBobáálovlováá J.,J., ŠŠlaislais K.,K., AnalAnal.. BioanalBioanal.. ChemChem, odesl, odesláánono 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 5959//6060 Kombinovaný sken IEF gelu frakcí z DF IEF piva Barevné pI markery skenované ihned po gel IEF Proteiny skenované po vybarvení Commassie Mazanec K.,Mazanec K., BobBobáálovlováá J.,J., ŠŠlaislais K.,K., AnalAnal.. BioanalBioanal.. ChemChem, odesl, odesláánono 9/21/20099/21/2009 IEFIEF 6060//6060