1
Bioanalytical Instrumentation
DNA analysis ­ genomics
Protein analysis ­ proteomics
Metabolite analysis ­ metabolomics/metabonomics
Glycomics, ...
Classical approaches
New technologies
Miniaturization ­ Mass Spectrometry
Technologie
Produkty
Následky
Mikroelektronika Mikrofluidika
?
Mikrofluidika?
Prostorová
úspora
Snížení
nákladů
hromadná
výroba
Rychlost
procesů
Kontrola elektrického proudu kontrola pohybu kapalin a rozpuštěných látek
Advion
Agilent
Caliper
Diagnoswiss
Gyros
Micronics
Nanogen
Nanostream
Zeptosyns
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 1 0 0 5 3 16
47
107
181
320
642
881
1002
1182
350
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed
1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
(as of April 9, 2008)
Incidence of the word "MICROFLUIDIC" in PubMed
1. Expozice 2. Vyvolání a leptání
maska
fotoresist
ochranná vrstva
(Cr, Au)
Substrát (sklo, křemík, ...)
3. Odstranění ochranné vrstvy 4. Uzavření struktury
Fotolitografie
2
* Substrates up to 100 x 100 mm2
* Structures down to 1 m
* Address grid down to 40 nm
* 3D exposure mode
* Standard or UV laser source
mPG 101 Tabletop Laser Pattern Generator
SILICON - ANISOTROPIC ETCHING
* Anisotropic etching ­ direction dependent etch rate
* Etch rate slower perpendicularly to the crystalline planes
with the highest density
* Typical etches: KOH, Tetramethyl Ammonium Hydroxide (TmAH)
Ethylene Diamine Pyrocatechol (EDP)
Alternative technologies
Hot embossing
Injection molding - production scale
Casting - polymeric resins, PDMS
Plasma etching
Laser machining
Intergace
1cm
sample in
waste inject
+ HV wash
liquid junction
(spray liquid)
ESI capillary in
Diffusion limited mixing Spatial flow focusing
3
Capillary force filling
Přesné dávkování velmi malých objemů
vzorek
přesně
definovaný
objem (nl)
hydrofobní značka
Mikrofluidika
Menší rozměry ­ rychlejší analýzy
Větvení kanálků bez mrtvého objemu
Paralelní systémy pro hromadné analýzy
Přístroje na jedno použití
Využití jevů, které se neuplatňují při velkých rozměrech
Úspora prostoru
Manipulace látek v kapalné fázi
Examples
New approaches for DNA analysis based on:
massively parallel PCR and pyrosequencing
(www.454.com)
or
microfluidics
and
high sensitivity (single molecule) detection
(www.helicosbio.com)
Sekvence lidského genomu za $ 1000?
J. Craig Venter
V současnosti 1000 x více
Mikrofluidika nezbytná
První možná cesta ­ Společnost 454.com
(www.454.com)
4
1 Schéma metody
1) Náhodné štěpení DNA na krátké úseky
2) Emulzní amplifikace na
28 m kuličkách
4) Sekvenace s pomocí mikročástic s
imobilizovaným enzymem a
chemiluminiscenční detekcí
3) Nanesení kuliček do 100 000
mikrokanálků na skleněné
destičce
44 m
Each Well contains a
single DNA Bead &
hundreds of enzyme
beads
Three current plate sizes:
300K Wells (25x75 mm
2
)
860K Wells (40x75 mm
2
)
1.6M Wells (70x75 mm
2
)
Bead Loading - 454 PicoTiterTM Plate
Sepharose
DNA Capture Bead
Containing Millions of
Copies of a Single
Clonal Fragment
A A T C G G C A T G C T A A A
A G T C A
Anneal Primer
* Simultaneous sequencing of the entire genome in hundreds
of thousands of picoliter-size wells
* Pyrophosphate signal generation
T
PP i
ATP
Light + oxy luciferin
Sulfurylase
Luciferase
APS
luciferin
Sequencing-By-Synthesis
191bp Perfect Read on 454 System
T
A
C
G
Cont.
1. Entire viral or bacterial
genome is loaded on
a PicoTiterTM plate
3. Load reagents
in a single rack
4. Sequence entire genome
at once, in real-time
2. Load PicoTiter
plate into instrument
454 Sequencing Instrument Ease of Use
5
System Performance
* 1 Person can sequence a genome from start to finish:
­ Single sample preparation from bacterial to human genomic DNA
­ Single amplification per genome with no cloning or cloning artifacts
­ Fast ­ days from new organism to annotated sequence
* 100X throughput improvement over Sanger sequencing:
­ 24-32 M high quality bases per run now, 20 Mbases per run minimum
­ Production read length of 100 bases
­ Consensus accuracy >99.99% with 10-15X oversampling
* First Proven New Sequencing Method:
­ Over 9 Different Bacterial Genomes completed multiple times
­ Multiple viruses & Human Gene Regions completed
­ First expression experiments (over 4M sequence reads) completed
­ First human oncology (karyotyping) experiments successful
2
tSMS -true Single
Molecule Sequencing
www.helicosbio.com
HeliScopeTM
Break
the DNA
ligate
fluorescent
universal
primer at
the 3' end
attach on
the polyT
modified
surface
record
positions
remove
fluorescent tag
sequencing
reaction
using
fluorescent
dNTP's
record
positions
remove
fluorescent
label and
repeat for
other dNTP's
1
2
3
4
5
6
7
Percentage of single molecule sequence reads
at or greater than a given length
86% of strands
70% of strands
50% of strands
28% of strands
Sequencing throughput 25 ­ 90 million usable bases per hour
Raw accuracy vs. read length > 99% ESI - concentration sensitive
(10 nL/min or 10 mL/min ­ similar sensitivity)
Charge competition
Different proton affinity
in the gas phase
Signal suppression
SEPARATION
6
MS IONIZATION - SIGNAL SUPRESSION
(ESI and MALDI)
+
+ + +
+ +
+
condensed phase phase transfer- ionization gas phase
MIXTURE
SEPARATED
COMPOUNDS
+ + +
+ +
+
+
++
+
+
Separation and Signal Suppression
1 min infusion CE-ESI/MS
279.2 459.4 639.6 819.8
Mass (m/z)
530.62
591.61
810.17
674.16
449.77
99.0 279.2 459.4 639.6 819.8
Mass (m/z)
449.82
810.24
674.23
591.61
530.62
Elektrosprej ­ spojení s hmotnostní spektrometrií
o
vzorek
~ 3000 V
mikrofluidický kanálek
CHIP ESI/MS COUPLING
* flat surface electrospray
* microfabricated tips
* external (inserted) tips
* external interface with a
transfer capillary
* integrated pneumatic nebulizer
* integrated liquid junction
Integrated Nebulizer
ESI exit
spray fluid
BGE waste
sample
nebulizer gas
10 mm
Zhang, B. Liu, H. Karger, B. L. Foret, F. Anal. Chem., 1999, 71, 3258-3264.
7
0 2.0 4.0
Time (min)
0
20
40
60
80
100
RelativeAbundance
m/z
400 1200
591.6
1181.7
Angiotensin I
des-AspI
450.5
899.5
630.6
775.4
m/z
400 1200
m/z
400 1200
m/z
400 1200
Angiotensin III
1-7
Angiotensin I
Bullfrog
Angiotensin III
3-8
Base peak
441.1
880.8
m/z
400 1200
Angiotensinogen 1-14
Porcine
1
2
3
4
5
Microdevice with Integrated Pneumatic Nebulizer
1. 2.
3. 4. 5.
2 4 6 8 10
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
100
2.0 4.0 6.0
Time (min)
0
50
RelativeAbundance
1.0 2.0 3.0 4.0
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
2.0 4.0 6.0
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
1.0 2.0 3.0
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
2 4 6 8 10
Time (min)
0
50
100
RelativeAbundance
Fetuin BSA
Chymo-
trypsinogen
-Casein-LactoglobulinCytochrome cUbiquitin
Carbonic
Anhydrase
PROTEIN TRYPTIC DIGESTS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min)
711.50-
712.50667.60-
668.20
571.60-
572.40545.20-
546.00
713.00-
713.40681.30-
681.90597.70-
598.50537.20-
537.70
821.00-821.60
842.80-846.30
1170.5-1171.0
1280.8-1281.6
734.00-734.60
1142.6-1143.2
689.60-690.20
664.50-665.00
789.70-790.50
1480.6-1481.2
1511.8-1512.3
927.90-928.50
1014.7-1015.3
1305.6-1306.2
660.50-662.00
1283.7-1284.3
649.50-650.50
1491.1-1492.1
923.20-924.20
1018.0- 1019.0
1179.6-1180.6
LKECCDKPLLEK
GACLLPKIETMR
KQTALVELLK
VASLR
SEIAHR
SLHTLFGDELCK
DTHKSEIAHR
ADEKK
KVPQVSTPTLVEVSR
LCVLHEK
HPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDK
*****
VLTSSAR
KQTALVELLK
AWSVAR
KFWGK
LVTDLTK
LGEYGFQNALIVR
VPQVSTPTLVEVSR
YLYEIAR
QTALVELLK
HLVDEPQNLIK
TPVSEK
HPEYAVSVLLR
IETMR
FGERALKAWSVAR
AEFVEVTK
VLTSSARQR
ECCDKPLLEK
PARALLEL SAMPLE INJECTION
8
100 mm
Špičky z napařeného zlata
1 mm
Si wafer
SU-8
Le Gac S., Arscott S., Rolando C. ELECTROPHORESIS 2003 , 24, 3640-3647.
Micro-nib electrospray source
(SU-8 on a silicon wafer)
Sjödahl, J., Melin, J., Griss, P., Emmer, A., Stemme, G., Roeraade, J. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 337--341.
ESI tips produced by DRIE in silicon ESI tip array
www.advion.com
DRIE in silicone Plasma etched
in polyimide
www.diagnoswiss.com
www.phoenix-st.com
Molded plastics
www.agilent.com
Capillary gel electrophoresis
Separation of nerve cell proteins
H. Hydén et al. Anal.Biochem, 17, 1-15, 1966.
1973
Instrumentation Miniaturization
"... the potential of nanotechnology is so vast
that it has been easy for researchers to get
lost in the wilderness of possibilities."
Stephen Empedocles co-founder of Nanosys Inc.,
Palo Alto, CA
"... (the researchers) say the quantum dots
can do amazing things. How do I make money
from them?"
Edward K. Moran, Nanotech Industry Practice,
Deloitte Services LP, NYC
9
Co je patent
Invention disclosure
Co má smysl patentovat
Vyhledávání
Kam se obrátit
Patentovat? Patentovat!
What Is a Patent?
A patent for an invention is the grant of a property right to the inventor,
issued by the United States Patent and Trademark Office. Generally, the term of a new
patent is 20 years from the date on which the application for the patent was filed in
the United States or, in special cases, from the date an earlier related application was filed,
subject to the payment of maintenance fees. U.S. patent grants are effective only
within the United States, U.S. territories, and U.S. possessions. Under certain
circumstances, patent term extensions or adjustments may be available.
What is granted is not the right to make, use, offer for sale, sell or import, but the right to
exclude others from making, using, offering for sale, selling or importing the invention. Once
a patent is issued, the patentee must enforce the patent without aid of the USPTO.
There are three types of patents:
1) Utility patents may be granted to anyone who invents or discovers any new and
useful process, machine, article of manufacture, or composition of
matter, or any new and useful improvement thereof;
2) Design patents may be granted to anyone who invents a new, original, and ornamental
design for an article of manufacture; and
3) Plant patents may be granted to anyone who invents or discovers and
asexually reproduces any distinct and new variety of plant.
Patentable subject
1. Does not fall under the laws of nature, natural phenomena or abstract ideas
2. Utility requirement - invention must be useful in association with machines,
human-made products, compositions of matter or processing methods
3. Novelty the idea must not be presented to the public before the filing
4. Nonobviousness ­ it must be unrecognizable to a skilled person
in the field of invention
5. Clarity of the description included in the application
Patent je zákonná ochrana vynálezů zaručující vlastníkovi
patentu výhradní právo k průmyslovému využití vynálezu.
V České republice udělování patentů upravuje zákon 527/1990. Podle něj se patenty udělují na
vynálezy, které jsou nové, jsou výsledkem vynálezecké činnosti a jsou průmyslově
využitelné.
Vynález se považuje za nový, jestliže není součástí stavu techniky.
Stavem techniky je všechno, co bylo zveřejněno přede dnem přihlášení patentu, ať již v České
republice nebo v zahraničí.
Za vynálezy se naopak nepovažují zejména :
objevy, vědecké teorie a matematické metody,
pouhé vnější úpravy výrobků,
plány, pravidla a způsoby vykonávání duševní činnosti,
programy počítačů,
pouhé uvedení informace
Majitel patentu má výlučné právo vynález využívat (tj. výrobek vyrábět, uvádět do oběhu nebo
upotřebit postup), dále poskytnout souhlas k využívání vynálezu jiným osobám (např. licenční
smlouvou) a má právo převést patent na jinou osobu.
Proto, aby patent zůstal v platnosti, je nutno platit tzv. udržovací poplatky, a to v každém
státu zvlášť. Maximální možná délka patentové ochrany je 20 roků.
http://cs.wikipedia.org/
www.uspto.gov
http://www.epoline.org/
10
http://isdvapl.upv.cz http://cz.espacenet.com/
11