1
ÚÚstav analytickstav analytickéé chemie AVchemie AV ČČR, v.v.i., VeveR, v.v.i., Veveřříí 97, 602 00 BRNO97, 602 00 BRNO
JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontrolyMetody kontroly
technologických procestechnologických procesůů
vývoj analytických metod, nadstavba analytickvývoj analytických metod, nadstavba analytickéé chemiechemie
se zamse zaměřěřeneníím na prm na průůmyslovmyslovéé procesyprocesy
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 MS/MS Precursor 1007.43 Spec #1 MC[BP = 749.4, 4569]
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
11JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
OBSAH
I. Výrobní proces
II. Správná výrobní praxe
III. Validace analytických procedur - příklad HPLC
IV. Kvalifikace přístrojů
V. Kalibrace a údržba laboratorních přístrojů
VI. Přenos analytických metod
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
22JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Vývoj analytických metod/systVývoj analytických metod/systéémumu  Validace analytických metod/systValidace analytických metod/systéémumu
KVALITAKVALITA

60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
33JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
I. VÝROBNÍ PROCES
Výrobní proces začíná:
- příjmem surovin
- jejich kontrolou
- kontrolou výrobního zařízení
Dalším krokem je:
- chemická reakce
- v případě biotechnologické výroby bioproces
Po chemické reakci následuje:
- izolace vzniklého meziproduktu
- izolace meziproduktu je většinou zároveň čisticí operací
Poslední operací:
- balení
Během celého procesu jsou prováděny:
- procesní kontroly
- konečné kontroly
Matečné louhy
Čistý produkt
Suroviny
Matečné louhy
Suroviny
Produkt
Surový produkt
Meziprodukt
Chemická reakce
Purifikace
Izolace
Purifikace
Finální operace
Balení
Suroviny
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
44JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Záznamy o laboratorních kontrolách ­ mají obsahovat následující údaje:
- popis vzorku včetně názvu materiálu, číslo šarže, data odběru vzorku a resp. množství a
datum dodání vzorku
- úplný záznam všech prvotních dat každého testu (grafy, kontrolní archy a spektra)
s uvedením testovaného materiálu a šarže
- záznamy všech výpočtů včetně jednotek a faktorů
- výsledky testu a srovnání se stanovenými specifikacemi
- datum každého testu a podpis osoby, která ho provedla
- datum a podpis další osoby dokazující, že originální záznam byl zkontrolován na
správnost, úplnost a shodu se specifikacemi
Úplné záznamy mají být rovněž uchovávány pro následující činnosti:
- všechny modifikace předepsané analytické metody
- periodické kalibrace laboratorních přístrojů, aparatur, měřidel a záznamových zařízení
- šetření výsledků mimo limity
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
55JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
II. SPRÁVNÁ VÝROBNÍ PRAXE ­ GMP
Současné požadavky GMP pro substance, které jsou označovány jako:
API (Active Pharmaceutical Ingredients) nebo BPC (Bulk Pharmaceutical Chemicals)
jsou dle předpisu ICH Q7A ,,Good Manufacturing Practice for Active Pharmaceutical Ingredients"
(Správná výrobní praxe pro farmaceutické účinné látky) rozděleny do následujících oblastí:
1. Úvodní informace
2. Řízení jakosti
3. Personál
4. Budovy a provozní zařízení
5. Procesní výrobní zařízení
6. Dokumentace a záznamy
7. Materiálový management
8. Výroba a průběžné výrobní kontroly
9. Balení a značení produktu a meziproduktů
10. Skladování a distribuce
11. Laboratorní kontroly
12. Validace
13. Kontrola řízení změn
14. Zamítnutí a nové použití materiálu
15. Reklamace a stahování z oběhu
16. Smluvní výrobci
17. Prodejci, distributoři a předřikování
18. Specifické směrnice pro substance vyráběné buněčnými kultivacemi nebo fermentací
19. Substance pro klinické studie
20. Slovník
2
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
66JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Fyzikální
zpracování
a balení
Další
extrakce
Řezání
a
počáteční extrakce
Sběr rostlin
Rostlinné extrakty
používané jako API
Fyzikální
zpracování
a balení
--
Řezání/
rozdrobňování
Sběr rostlin nebo
kultivace a
odebírání
API z rozdrobněných
nebo práškovaných
rostlin
Fyzikální
zpracování
a balení
Izolace a
purifikace
Zavedení
buněk do
fermentace
Uchovávání
buněčné banky
Ustavení
buněčné banky
,,Klasická" fermentace
pro produkci API
Fyzikální
zpracování
a balení
Izolace a
purifikace
Buněčná
kultura nebo
fermentace
Uchovávání
pracovní buněčné
banky
Ustavení řídící
buněčné banky a
pracovní buněčné
banky
Biotechnologie/
fermentace
Buněčná kultivace
Fyzikální
zpracování
a balení
Izolace a
purifikace
Zavedení
výchozího
materiálu do
procesu
Řezání,
směšování nebo
prvotní zpracování
Sběr orgánů
tekutin nebo
tkání
API ze živočišných
zdrojů
Fyzikální
zpracování
a balení
Izolace a
purifikace
Zavedení
výchozího
materiálu do
procesu
Řezání a prvotní
extrakce
Sběr rostlin
API extrahovaná
z rostlinných zdrojů
Fyzikální
zpracování
a balení
Izolace a
purifikace
Produkce
meziproduktů
Zavedení
výchozího
materiálu do
procesu
Produkce
výchozího
materiálu
Chemická výroba
Aplikace GMP na výrobní krokyDruh výroby
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
77JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
III. VALIDACE ANALYTICKÝCH PROCEDUR
Validace = potvrzení platnosti
- slouží k ověřování vhodnosti, správnosti a spolehlivosti vypracované
analytické metody
- proces, při němž se určuje vhodnost použití daného (analytického)
systému pro získání relevantních dat
- při validaci posuzujeme, zda jsou parametry metody srovnatelné
s požadavky na výsledky
- hledáme vztah mezi požadavky na výsledek a vlastnostmi metody
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
88JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
Poet publikací
1 2 3 4 5 6
roky
Poet publikací
1960 1970 1980 1990 2000 2008
Počet publikací
Počet
publikací
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
99JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
The International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
* U.S. Food and Drug Administration(FDA)
* European Federation of Pharmaceutical Industries Assoc.(EFPIA)
* Ministry of Health and Welfare, Japan(MHW)
* Japan Pharmaceutical Manufactures Assoc. (JPMA)
* European Commission-European Union (EU)
* Pharmaceutical Research and Manufactures of America(PhRMA)
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1010JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Úvod:
- validace analytických metod je vyžadována v rámci registrace léčiv
- kromě vlastního postupu metody, je nutné v rámci registrační
dokumentace zdůvodnit i volbu metody a její možnosti
- samotná validace musí být doložena výsledky, které prokazují její vhodnost
Předpisy pro validaci analytických procedur vydané v rámci tzv.
,,Mezinárodní konference pro harmonizaci":
ICH Q2A: Text on Validation of Analytical Procedures
ICH Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1111JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Typy analytických procedur:
- GMP vyžaduje detailní popis každé analytické procedury formou postupných kroků
- Popis zahrnuje:
1. přípravu reagencií, referenčního standardu, vzorků
2. použití přístroje (systému)
3. sestrojení kalibrační křivky
4. použití kalkulačních vztahů
3
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1212JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Validace analytických procedur:
- předmětem validace je demonstrace vhodnosti analytického postupu pro
zamýšlený účel
- míra vhodnosti je posuzována pomocí definovaných parametrů, mezi které patří
především:
- správnost (accuracy)
- přesnost (precision)
- opakovatelnost (repeatability)
- mezioperační přesnost (intermediate precision)
- reprodukovatelnost (reproducibility)
- specifičnost (specificity)
- detekční limit (detection limit)
- kvantitativní limit (quantitation limit)
- linearita (linearity)
- rozsah (range)
- robustnost (robustness)
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1133JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Správnost metody
- Správnost analytické metody představuje míru shody buď konvenčně správné
(pravdivé) hodnoty, nebo přijaté referenční hodnoty s hodnotou stanovenou
- Správnost se posuzuje na vzorcích, do kterých jsou přidána známá množství
nečistot a má být posuzována s použitím nejméně 9 stanovení v rozmezí
nejméně 3 koncentračních hladin, které pokrývají specifikovaný rozsah
(např. 3 koncentrace/3 opakování)
- O správnosti se podává zpráva v percentech získaných stanovením obsahu
známého přidaného množství analyzované látky ke vzorku, nebo jako rozdíl
mezi střední hodnotou a skutečnou (referenční) hodnotou s uvedením intervalů
spolehlivosti
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1144JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Metodický postup:
Správnost analytické metody indikuje systematickou chybu a lze ji posoudit
některým z uvedených postupů:
a) Při porovnání výsledků s výsledky jiné nezávislé metody se statisticky
porovnávají dva soubory nezávislých výsledků (získaných testováním stejného
homogenního vzorku) na shodnost (T-test) a variaci (F-test). Analytická metoda se
považuje správnou, pokud na hladině významnosti =0,05 není rozdíl mezi oběma
soubory statisticky významný.
b) Při metodě standardního přídavku se porovnávají získané výsledky
s výsledky získanými metodou přímého stanovení. Hodnocení správnosti je stejné
jako při porovnávání výsledků s nezávislou metodou.
c) Testování modelového vzorku, který byl připraven z placeba a známého
přidaného množství standardu, které je považováno za skutečnou hodnotu.
Statisticky se vyhodnocuje průměrná hodnota tzv. výtěžnosti (recovery).
Recovery = 100 x nalezená hodnota/skutečná hodnota
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1155JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Přesnost
- Představuje míru shody mezi sérií výsledků získaných mnohonásobnou
analýzou vzorku za předepsaných podmínek
Metodický postup:
Přesnost lze vyhodnocovat ve třech úrovních:
a) Opakovatelnost je přesnost výsledků analýz provedených za stejných podmínek
v krátkém časovém intervalu (posouzena v téže laboratoři, stejným analytikem, na stejném
přístroji, ve stejný den a s použitím stejných chemikálií a roztoků.
Pro posouzení se používá:
1. minimálně 9 stanovení, pokrývajících specifikovaný rozsah analytické procedury (např. 3
koncentrace/3 opakování)
2. minimálně 6 stanovení při 100 % koncentraci daného testu
Statisticky je vyjadřována ­ směrodatná odchylka, relativní standardní odchylka a interval
spolehlivosti průměrné hodnoty
b) Mezioperační či laboratorní přesnost vyjadřuje variabilitu v rámci laboratoře (různé
přístroje, analytici, dny, chemikálie apod.)
c) Reprodukovatelnost je přesnost mezi laboratořemi - komparativní studie mezi
laboratořemi určené ke standardizaci metodologie
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1166JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Specifičnost metody
- Specifičnost analytické procedury představuje její schopnost ocenit jednoznačně
analyzovanou látku v přítomnosti očekávaných komponent (nečistot, doprovodných
látek apod.)
- Selektivita metody se mění v závislosti na koncentraci stanovovaného analytu, v
závislosti na koncentraci ostatních komponent matrice
- Použitelnost metody by měla být studována pomocí různých vzorků od čistých
etalonů po směsi s komplexními matricemi
Metodický postup:
a) Analyzujeme n-krát (n > 10) vzorek čistého analytu - střední hodnota
b) Analyzujeme n-krát vzorek čistého analytu s přídavkem příměsi v takových koncentracích, které jsou
přibližně stejné jako v reálné matrici - střední hodnota
c) Testování shody středních hodnot. Pokud je zamítnuta hypotéza o shodě, vypočteme korekční faktor.
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1177JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Detekční limit (DL)
-Představuje nejnižší množství látky ve vzorku, které může být detekováno, ale
které není nutně kvantifikovatelné jako exaktní hodnota
-Limit je nutný pro limitní testy, kdy je dokazováno, že množství analyzované látky
je nad nebo pod detekční limit
Metodický postup:
a) Vizuální hodnocení (neinstrumentální metody)
b) Na základě poměru signálu k šumu základní linie (provádí se porovnáním
naměřených signálů ze vzorků se známými nízkými koncentracemi analyzované
látky se signály ze slepých vzorků a stanovením nejmenší detekovatelné koncentrace.
Přijatelný poměr signálu k šumu základní linie - 3:1 nebo 2:1
c) Na základě směrodatné odchylky odezvy a směrnice
kde  = směrodatná odchylka odezvy
S = směrnice kalibrační křivky
S
DL
s.3,3
=
4
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1188JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Kvantitativní limit (QL)
- Představuje nejnižší množství látky ve vzorku, kterou lze stanovit jako exaktní
hodnotu se stanovenou přesností a správností
Metodický postup:
a) Vizuální hodnocení (neinstrumentální metody)
b) Na základě poměru signálu k šumu základní linie (provádí se
porovnáním naměřených signálů ze vzorků se známými nízkými
koncentracemi analyzované látky se signály ze slepých vzorků a
ustavením minimální koncentrace, při níž může být analyzovaná látka
spolehlivě kvantifikována. Typický poměr signálů je 10:1
c) Na základě směrodatné odchylky odezvy a směrnice
kde  = směrodatná odchylka odezvy
S = směrnice kalibrační křivky
S
QL
s.10
=
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
1199JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Linearita
- Schopnost metody dávat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované
látky ve vzorku
- Zjištění lineární části kalibrační závislosti se provádí s využitím regresní
diagnostiky
- Po vyhodnocení získáme přímkový regresní model Yreg = b0 + b1c
Metodický postup:
a) Proměření kalibrace dle experimentálního plánu
b) Testování homogenity rozptylů
c) V části kalibrační křivky, kde je prokázána shoda rozptylů se testuje
linearita nejčastěji některým z F testů
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2020JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Rozsah
- Rozsah analytické procedury představuje interval mezi horní a spodní
koncentrací analyzované látky ve vzorku, pro kterou bylo demonstrováno,
že analytická procedura má odpovídající přesnost, správnost a linearitu
- Pro stanovení obsahu léčivé látky obvyklý rozsah je 80 - 120 % testované
koncentrace
Metodický postup (pro pracovní rozsah):
a) Změříme závislost analytického signálu na koncentraci v nejširším možném
intervalu koncentrací včetně slepého pokusu.
b) Zobrazíme závislost vhodným statistickým programem.
c) Na základě subjektivní úvahy zvolíme předpokládanou lineární oblast.
d) V této oblasti znovu experimentálně metodu kalibrujeme, přičemž uvažujeme
vliv matrice a kalibrujeme při optimální kombinaci významných faktorů.
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2121JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Robustnost
- Kritické parametry měření a jejich tolerance musí být známy pro každý
analytický postup (např.: pH, teplota, čistota a stáří činidel, vlhkost)
- V testu se zkoušejí pozměněné objemy, časy, navážky, vlivy různých šarží
činidel apod.
- Cílem je prokázat spolehlivost analytické procedury vzhledem na úmyslné
variability parametrů metody
V případě kapalinové chromatografie bývají typickými příklady variabilit:
a) vliv pH v mobilní fáze
b) vliv složení mobilní fáze
c) různé kolony (různé šarže nebo dodavatelé)
d) teplota
e) průtoková rychlost
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2222JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
SHRNUTÍ
Jak dosáhnout kvalitních produktů?
- Abychom získali smysluplné výsledky je nezbytná validace metod.
- Validaci je třeba plánovat a provádět v souladu s analytickými
požadavky.
- Vhodné způsoby validování závisí na aplikační oblasti.
- Pracovníci by měli rozumět jednotlivým validačním parametrům.
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2323JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
PŘÍKLAD HPLC
- Předmětem validace analytických procedur je demonstrace vhodnosti analytického
postupu pro zamýšlený účel
- Vlastní provedení validace analytické procedury představuje pečlivé naplánování
analýz vhodných vzorků, získaní odpovídajících analytických dat a jejich zpracování
ve shodě s požadavky pro jednotlivé charakteristiky
Validační protokol
- schvalovací list
- validační tým
- popis analytické procedury
- experimentální podmínky
- způsoby hodnocení validačních charakteristik a kritéria přijatelnosti
- harmonogram
- formuláře
Schvalovací list - uvedeni a podepsáni autoři, posuzovatelé a schvalovatelé plánu
validační studie
Validační tým - zahrnuje osoby, které se zúčastní validační studie včetně jejich
funkce ve validačním týmu
5
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2424JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Popis analytické procedury - nutné uvést
- princip metody
- požadované materiály
 specifikace standardů, chemikálií, rozpouštědel
 způsob přípravy mobilní fáze
 způsob přípravy roztoků standardů a vzorků
- popis a způsob použití HPLC systému, zařízení a vybavení
 kondicionace systému
 posouzení způsobilosti systému
 kalibrace a rekalibrace systému
 způsob provádění analýz a získávání dat
- zpracování a vyhodnocení dat
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2525JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Experimentální podmínky - nutné uvést
- všechny předpokládané podmínky pro provedení dané validační studie
- HPLC systémy
 specifikace (autosamplery, pumpy, kolony,
termostaty, detektory, řídící systém)
 informace o kvalifikaci-IQ, OQ, PQ
- ostatní přístroje a měřidla (váhy, termostat, lednice, ultrazvuková
lázeň, vakuová pumpa)
 specifikace
 informace o kalibraci resp. kvalifikaci
- laboratorní sklo
 specifikace resp. certifikáty
- materiály (standardy, vzorky, chemikálie, rozpouštědla, pomocné
materiály)
 specifikace resp. certifikáty
 podmínky skladování a doba použitelnosti
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2626JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Způsoby hodnocení validačních charakteristik a kritéria přijatelnosti
SPECIFIČNOST - schopnost procedury ocenit jednoznačně analyt v přítomnosti očekávaných komponent
- rozlišit analyt
- stanovit analyt s přidanými komponentami
Podmínky testování
Systém: HPLC
Rozsah: SST - test způsobilosti systému
IDENT - test identity analytu
CAL - kalibrace a ověřování
INDEP - test nezávislosti výsledků
REPLIC - test přesnosti výsledků
SST - test způsobilosti systému
- provedení
HPLC systém se nechá kondicionovat
Připraví se roztok standardu analytu v mobilní fázi
Provede se 6 analýz roztoku
Vypočte se RSD ploch píků
- kritérium přijatelnosti
RSD < 0,71 %
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2727JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
IDENT ­ test identity analytu
- provedení
Připraví se roztoky:
mobilní fáze
placebo
placebo a analyt
placebo a analyt a rozkladné produkty
vzorek produktu
vzorky po zátěži
- kyselá hydrolýza, 80 °C, 24 hod
- alkalická hydrolýza, 80 °C, 24 hod
- oxidace, 3 % H2O2, 80 °C, 4 hod
- fotolýza, 30 ­ 60 °C, 4 hod
Zhotoví se reprezentativní chromatogramy, identifikují se komponenty a provede se vizuální
inspekce všech píků
Pro píky analytu se vypočítají počet teoretických pater, kapacitní faktor, faktor symetrie, rozlišení
píků
- kritérium přijatelnosti
Žádné opožděné píky
Prokázaní shodnosti UV spekter
Pro všechny individuální hodnoty píku analytu:
- faktor symetrie < 0,8
- rozlišení > 1,5
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2828JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
CAL - kalibrace a ověřování
- provedení
Připraví se roztoky standardu analytu o koncentraci 50, 80, 100, 120 a 150 % v mobilní fázi
Sestrojí se kalibrační křivka
- kritérium přijatelnosti
Korelační koeficient kalibrační křivky > 0,999
INDEP ­ test nezávislosti výsledků
- provedení
Připraví se 6 dvojic roztoků:
placebo a analyt
placebo a analyt a rozkladné produkty
Všechny roztoky se analyzují dle náhodného schématu
Výsledky pro dvojice odpovídajících roztoků se porovnají statistickým testem na párovou shodnost
- kritérium přijatelnosti
Test párové shody má vyloučit vliv rozkladných produktů na stanovení analytu ve vzorku
REPLIC ­ test přesnosti výsledků
- provedení
Připraví se 6 roztoků vzorku produktu
Výsledky se statisticky zpracují
- kritérium přijatelnosti
RSD < 1,67 %
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
2929JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
LINEARITA ­ schopnost vyjádřit proporcionální vztah mezi nalezenými výsledky a koncentrací
analytu ve vzorku
- provádí se pro minimálně 5 koncentračních úrovní
- požadovaná data: parametry regresní přímky, korelační koeficient, grafické
znázornění závislosti
SPRÁVNOSŤ ­ míra shody pravdivé hodnoty, nebo přijaté referenční hodnoty s hodnotou
stanovenou
PŘESNOST ­ míra shody výsledků homogenního vzorku získanými jeho mnohonásobnou
analýzou
RANGE ­ představuje interval mezi horní a dolní koncentraci analytu ve vzorku
Podmínky testování
Systém: HPLC
Rozsah: LIN ­ test linearity výsledků
ACPR ­ test správnosti a pečlivosti výsledků
ROBUSTNOST ­ míra odolnosti procedury k malým, ale záměrným variacím parametrů metody
TEST ZPŮSOBILOSTI SYSTÉMU ­ zařízení, procedura a vzorky tvoří integrální systém
Podmínky testování
Systém: HPLC
Rozsah: STAB ­ test stability výsledků
ROBUST ­ test robustnosti (Plackett-Burmanův návrh experimentu)
6
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3030JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Harmonogram
- testovací plán
- podmínky testování
- dobu testování
- odpovědnou osobu
Formuláře
- celkový kontrolní list
- formuláře pro individuální testy
Validační zpráva
- záznamy z testování
- tabulky a diagramy
- kalibrační certifikáty
Monitorování analytické procedury
- kalibrační faktor
- rozlišení mezi významnými píky
- faktor symetrie píku analytu
- počet teoretických pater
- opakovatelnost nástřiku
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3131JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3232JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Analytica Chimica Acta 647 (2009) 226­230
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3333JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Analytica Chimica Acta 647 (2009) 226­230
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3434JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
IV. KVALIFIKACE PŘÍSTROJŮ
Postup při validaci analytických přístrojů a zařízení, používaných v laboratořích.
Základní stupně validace:
1. Kvalifikace projektu (Design Qualification, DQ)
2. Instalační kvalifikace (Installation Qualification, IQ)
3. Operační kvalifikace (Operational Qualification, OQ)
4. Procesní kvalifikace (Process/Performance Qualification, PQ)
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3535JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
1. DQ = popisuje a ověřuje návrh požadavků a specifikace přístroje a dává detailní
podklady pro významná rozhodnutí při volbě dodavatele.
Hlavním smyslem DQ je potvrdit, že:
a) pro specifické úkoly byl vybrán správný druh zařízení,
b) zařízení odpovídá předpokládanému použití,
c) dodavatel vyhovuje kvalifikačním kriteriím uživatele.
2. IQ = prokazuje, že přistroj byl dodán podle projektu a jak bylo specifikováno
Hlavním účelem IQ je ujistit se, že:
a) zařízení bylo dodáno podle objednávky,
b) součásti dodávky je příslušná dokumentace
c) zvolené okolní prostředí vyhovuje specifikacím,
d) jednotlivé moduly a veškerá příslušenství jsou správně nainstalovány a
vzájemně přepojeny,
e) SW je kompletně instalován
f) přístroj ve zvoleném prostředí funguje (základní testy-test ROM, RAM,
displeje, dálkových propojení).
3. OQ = proces, kterým se prokazuje, že přistroj bude fungovat ve zvoleném prostředí
podle svých operačních specifikací.
7
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3636JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Příklad testů pro HPLC
Správnost průtokové rychlosti
Postup testu: Změří se průtoková rychlost odměrnou baňkou a stopkami nebo kalibrovaným
digitálním průtokoměrom.
Limity přijatelnosti:  5 % od deklarovaném hodnoty
Frekvence testu: Ročně
Přesnost průtokové rychlosti
Postup testu: 5 nástřiků standardu, z retenčních časů se vypočte relativní směrodatná
odchylka (RSD).
Limity přijatelnosti: RSD < 2 %
Frekvence testu: Ročně (doporučený standard kofein)
Přesnost ploch píků
Postup testu: 5 nástřiků standardu, z ploch píkú se vypočte relativní směrodatná odchylka
(RSD).
Limity přijatelnosti: RSD < 2 %
Frekvence testu: Ročně (doporučený standard kofein)
Správnost teploty termostatu pro kolony
Postup testu: Změří se teplota v termostatu pro kolony a porovná se s nastavenou hodnotou.
Limity přijatelnosti:  1 °C od deklarovaném hodnoty
Frekvence testu: Ročně
Přesnost teploty termostatu pro kolony
Postup testu: Po dobu 20 minut se měří teplota kolony při 40 °C.
Limity přijatelnosti:  0,5 % od ustálené hodnoty
Frekvence testu: Ročně
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3737JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Šum základní linie
Postup testu: Po dobu 20 minut se zaznamenává základní linie. Měří se šum pík-pík v sekcích po 1
min. Výsledky se zprůměrňují.
Limity přijatelnosti:  1 x 10-4 AU
Frekvence testu: Ročně
Linearita detektoru
Postup testu: Nastříkne se 5 standardů kofeinu o různé koncentraci. Měří se závislost odezvy proti
množství. Vypočte se odchylka nebo korelační koeficient ().
Limity přijatelnosti: odchylka  5 % nebo   0,999 pro odezvu  1,5 AU
Frekvence testu: Ročně
Správnost vlnové délky UV/VIS detektoru
Postup testu: Skenuje se látka se známým spektrem. U absorpčních maxim se odečte vlnová délka a
porovná s deklarovanou.
Limity přijatelnosti:  2 nm deklarované hodnoty (pro každé maximum)
Frekvence testu: Vždy po 3 měsících a kdykoliv se detektorem pohne.
Přesnost automatickým injektorem (autosamplerem)
Postup testu: Nastříkne se standard, poté slepý vzorek (blank) a změří se poměr ploch píků blanku a
standardu.
Limity přijatelnosti:  0,3 %
Frekvence testu: Ročně
Správnost míchání mobilní fáze
Postup testu: Nastaví se míchání fází na 10, 11, 50 a 90 % mobilní fáze s acetonem a úroveň odezvy
se vztáhne na 100 %.
Limity přijatelnosti:  2 %
Frekvence testu: Ročně
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3838JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
4. PQ = proces, kterým se dokazuje, že přístroj soustavně pracuje podle
specifikací, které jsou přiměřené pro jeho rutinní používání
PQ má zahrnovat:
a) definice kritérií procesního chodu a testovacích postupů,
b) výběr kritických parametrů např. pro chromatografický systém:
- šum základní linie,
- přesnost nástřiku,
- přesnost retenčních časů,
- rozlišení,
- šířka píku v polovině výšky,
- faktor chvostování.
c) kritéria přijatelnosti,
d) definice opravných akcí
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
3939JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
V. KALIBRACE A ÚDRŽBA LABORATORNÍCH PŘÍSTROJŮ
Program kalibrace a údržby laboratorních přístrojů a měřidel - součástí správné
praxe
Výsledky mimo limit - OOS ,,out of specification"
C.L. Nielsen ,,Managing the Analytical Laboratory ­ Plain and Simple" (1996)
Pro vytvoření a provozování efektivního programu musí byt zváženy následující
aspekty:
a) úplná přístrojová dokumentace
b) standardní operační předpis pro provádění kalibrace, údržby a servisu pro
každý přístroj
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4040JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Intervaly laboratorní kalibrace/údržby
- analytické váhy 1 den
- předvážky 1 měsíc
- pH metry při použití
- HPLC 3 měsíce
- GC 6 měsíců
- UV 6 měsíců
- Teploměry 1 rok
- Sušárny 1 rok
- Chladničky 1 rok
Dokumentace a registr přístrojů a příslušenství
- provozní deník
a) datum kalibrace
b) jméno pracovníka
c) datum kalibrační exspirace
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4141JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
SHRNUTÍ
- Program kalibrace a údržby laboratorních přístrojů je nedílnou
součástí správné výrobní praxe.
- Základní význam tohoto systému: ,,Poskytovat spolehlivé výsledky".
8
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4242JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
VI. PŘENOS ANALYTICKÝCH METOD
Významný problém při vývoji léčiv je přenos analytických metod mezi laboratořemi.
- organizace ISPE (International Society for Pharmaceutical
engineering) vydala pokyn ,,Technology transfer"
 typy lékových forem:
- pevné
- parenterální
- inhalační
- polotuhé, masti, krémy
- tekuté, suspenze
- transdermální
- oční
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4343JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
 seznam typických metod pro testování lékových forem, které
mají být přenášeny:
- stanovení obsahu
- uniformita obsahu
- nečistoty, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla
- disoluce/rychlost uvolňování
- testy totožnosti
- verifikace čištění
- mikrobiologické testování
- sterilita
- podávaná dávka
- fyzikální kritéria
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4444JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
ZÁVĚR
Jak vybrat z mnoha metod nejlepší postup?
1. Identifikovat problém ­ požadovaná informace (typ analýza, ...).
2. Nalézt faktory, které je nutné posuzovat (kritéria: jaká přesnost, správnost,
linearita...).
3. Identifikace interferencí.
4. Volba metody (vyhledání vhodných metod v literatuře, normách, modifikace
existujících metod).
5. Provedení validace metody.
6. Provedení validace analytických přístrojů a zařízení, používaných v laboratořích.
60 260 460 660 860 1060
Mass (m/z)
456.9
0
10
%Intensity
4700 M S/ M S Precursor 1007. 43 Spec #1 M C[ BP = 749. 4, 4569]
4545JanetteJanette BobBobááľľovováá
Metody kontroly technologických procesů
Literatura
1. Green, J. M.: A Practical Guide to Analytical Method Validation.
Analytical Chemistry 1996, 68, 305A-309A.
2. Vessman, J. et al.: Selectivity in analytical chemistry. Pure Appl.
Chem., 2001, 73, 1381­1386.
3. Figer, P.; Koruna, I: Správná laboratorní praxe ­ historie, zavádění,
legislativa a zásady SLP. CHEMagazín 2005, 5, ročník XV.
4. Barek, J. et al.: Metrologická terminologie v chemii. Chem. Listy,
2000, 94, 439­444.
5. ČSN EN ISO 9000:2001. Systémy managementu jakosti. Základy,
zásady, slovník.
6. ČSN 01 0251. Stanovení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti
normalizované zkušební metody pomocí mezilaboratorních
zkoušek.