ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody - Rayleighův rozptyl - kvazielastický rozptyl - Ramanův rozptyl - fluorescence ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody - TEORETICKÉ ZÁKLADY rozptylových jevů u. pozorování rozptylu na heterogenitách v. závislost intenzity rozptylu na vlnové délce i^ energie dopadajícího a rozptýleného fotonu v. změna energie rozptylujícího objektu v. kvazielastický rozptyl V- velikost makromolekul, koloidních částic v. Ramanův rozptyl V. struktura molekul, krystalů, supramolekul Ramanova spektroskopie Každá čára Ramanova spektra je svými vlastnostmi závislá na počtu a hmotě společně kmitajících atomů molekuly^ na jejich prostorovém uspořádání a na vnitřně molekulovém silovém poli. Je zrejmer že Ramanovych spekter lze použíti analyticky. zvláště při řešení některých, chemicky těžko dôkazovatelných rozdílů konstitučních. r "sr Prof. Dr. Arnošt Okac Výklad k základním operacím v chemické analyse JČMF 1948 Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Podstata Ramanova jevu ROZPTYL ZÁŘENÍ - rozptýlený foton má odlišnou energii oproti dopadajícímu zářivý dvoufotonový přechod mezi dvěma stacionárními vibračními stavy molekuly, jejichž energie jsou E, a E2, vyvolaný interakcí s fotonem dopadajícího záření o frekvenci v0 > I E2 - E1\lh, provázený vyzářením rozptýleného fotonu o energii h vR= h v0 ± (E2 - E,), kdehvvib = £2"Ei Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie První elektronovv excitovaný stav Zá Ida duí elektronový stav Excitace Vibrační kvantové číslo virtuální hladiny ^^anti v=4 v=3 v=2 v= 1 v=0 =?£^ r0 V-V .. o vib Stokes V +V ib v=4 v=3 v=2 v=l v=0 i=ř O VoVvib Stokes Vo+Vvä anti-Stokes normální rezonanční Schéma dvoufotonových přechodů Ramanův a Rayleighuv rozptyl při excitaci normální a rezonanční Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Základní výběrové pravidlo Ramanova rozptylu změna polarizovatelnosti během vibračního pohybu \da ^■v *° \dq Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Vibrační frekvence molekul .jsou nezávislé r\Q tom, zda je studujeme infračervenou nebo Romanovou spektroskopií, avšak intenzity spektrálních linií budou pro obě spektroskopické techniky zřetelně odlišné. Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie V Romanově spektru je intenzita pásu úměrná druhé mocnině změny polarizovatelnosti během vibračního pohybu (öalöq)2, zatímco v infračerveném spektru je úměrná druhé mocnině změny dipólového momentu. Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie :vz. 16 IR C/) -Q < O oo CM CNI JKJL 0,12 vz. 16 010 ^Raman 0,08 | c 0,06 0,04 0,02 3000 •o****« 2000 Wavenumbers (cm-1) 1000 Principy Ramanovy a FT Ramanovy spektroskopie Vztah intenzity pásů - možnost měření teploty vzorku anti-Stokes __ ^ Stokes f , ^ \V0~ Vvib J 4 h vvib 1 kr e Principy Ramanovy spektroskopie o co ID ÍN O -i—I on c E CĽ O o o o üD crjLD ÜD ^r ^r on onon v- t- fN ^r oo 3; LD oo ^ ^f t- t- ON ON práí ková p JÄii uJUv 400 200 0 Wavenumber cm Ia. -400 -1 Experimentální výhody • možnost měření ve vodném prostředí v. nízká intenzita Ramanova rozptylu pro vodu v. používané optické materiály nejsou citlivé na vlhkost • možnost měření ve skleněných nádobách v. měření v uzavřených ampulích - např. pod vakuuem • snadné využití skelné vláknové optiky • minimální požadavky na úpravu pevných vzorků • intenzivní pásy -C=C-, -N=N-, -S-S- a dalších symetrických vibrací Instrumentace Lasery pi TYP laseru vlnová délka [nm] He-Ne 632,8 Ar* 514,5 Ar* 488,0 Ar* 457,9 Kr* 568,2 Kr* 647,1 Kr* 676,4 Kr* 752,6 Nd-YAG 1064 Nd-YAG - 2f 532 diodové 780, 785 - NIR barvivové 360 - 750 - UV, vis Schéma Ramanova disperzního přístroje LASER ■ i VZOREK OBJEKTIV FILTR V r CCD detektor OTOCNA MŘÍŽKA ZRCADLA r V V VSTUPNÍ STERBINA Schéma Ramanova mikroskopu ~4 " ----------? ľ----------w Z r Mikroskopický objektiv 1 Oddělení Ramanova 0d8traneni rozptylu od excitujícíhop|asmových |inij m zareni Vzorek na x-y-z stolku í É Mikroskopický objektív 2 \gzaT __f__Pinhole Spektrograf i 'I CCD camera Externí sondy připojené pomocí vláknové optiky Křemenná vlákna Fokusační zrcadla Vysoce světelné objektivy z kvalitního optického skla Mobilní přístroje Principy FT Ramanovy spektroskopie Schéma FT Ramanova spektrometru s NIR excitací Instrumentace Materiály pro dělič paprsků Propustný materiál Polopropustny povlak rozsah použití [cm1] křemen Si (Fe203) 23 000 - 4 000 CaF2 Si (Fe203) 10 000-1000 KBr Ge 4 700 - 350 Icsl_________ Ge 4 000 - 200 | Speciální techniky • rezonanční - RR • povrchem zesílený - SERS • rezonanční povrchem zesílený SERRS • fotoakustický - PARS • hyperRaman • koherentní anti-Stokes - CARS • koherentní Stokes - CSRS Studované materiály VZORKY • anorganické - korozní vrstvy - povrchy pevných disků, křemík - amorfní uhlík, diamanty • organické - supramolekulární systémy - systémy na nosičích • polymery - fotolabilní materiály • biologické - in vitro, in vivo • geologické - minerály, horniny • archeologické - od paleolitu po novověk Studované materiály GEMMORAMAN ■1980 drahokamy FRESCORAMAN ■1980 anorg. barviva ICONORAMAN ■1985 org. barviva PETRORAMAN ■1995 kameny Ires in Oram an ■1995 amorf. org. m. I TISSUERAMAN ■1997 tkáně CERAMORAMAN ■1998 keramika METALLORAMAN ■1999 koroze kovů VITRORAMAN ■1999 skelný stav CLI MATORAMAN ■1999 vlivy klimatu na m. Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod Ramanova spektrometrie -ANALÝZA MATERIÁLŮ - polovodiče - kontrola povrchu pevných disků, Seagate 1992 - magnetických hlav - uhlíkové materiály ^ ■ o Analýza uhlíkatých materiálu xlOOO íoo ^ • 80 -\ 3 cti -P 60 -| ■H 0) 0) +> ß H 40 H 20 -\ o H DLC uhlíková *++—*»**—******* m**» diamant sp 1 500 1000 1500 Wavenumber (cm1) 2000 Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod FT Ramanova spektrometrie - ANALÝZA ropných produktů - stanovení oktanového čísla - analýza automobilových olejů - stanovení obsahu alkoholu - kontrola biotechnologií - analýza ve farmaceutickém průmyslu Identifikace drog morphine JL/AMw*AMJ*kA*Ajij^^ heroin i* mu laiím JÜLAah^Ij^^ ~i---------1---------1---------1---------1---------r 3000 2500 2000 1500 1000 500 Raman shift (cm-1) Identifikace léčiv Ě CO z: LU < Ľ -i—i—i—i—t—t—i f P I—T—I—P—I-—P—I—p—P——I—I—r aspirín uu vxj ij^j^j IBUPROFEN U 0 200 400 600 800 1000 FREQUENCY SHIFT (cm1) 1200 Fluorescence Fluorescence a fosforescence excitované rotační stavy excitované vibrační stavy excitované elektronové stavy s LU S o ic VNITRNÍ KONVERZE isc MEZISYSTÉMOVÝ PŘECHOD — To ic ABSORPCE FLUORESCENCE Ti FOSFORESCENCE ZÁKLADNI ELEKTRONOVÝ STAV Fluorescence a fosforescence • luminiscence s krátkým dosvitem - spinově dovolený přechod - bez změny orientace elektronového spinu •FOSFORESCENCE • luminiscence s dlouhým dosvitem - spinově zakázaný přechod - změna orientace elektronového spinu • možný díky spin-orbitální interakci Fluorescence a fosforescence • DOBA ŽIVOTA EXCITOVANÉHO STAVU - kinetika „zániku" excitovaného stavu INTENZITA fluorescence a fosforescence - KVANTOVÝ VÝTĚŽEK cp=N?/N ABS • počet vyzářených fotonů vůči počtu absorbovaných - VLIV NEZÁŘIVÝCH PROCESŮ - intra- a inter- molekulárních Fluorescence a fosforescence • STRUKTURA MOLEKULY - dvojné vazby - aromáty, konjugované C=C - heteroatomy - C=0, dusíkaté heterocykly - VLIV SUBSTITUENTŮ - -OH, -NO, -N02 ... - RIGIDITA struktury n-elektronového systému - CHELÁTY • MEZIMOLEKULOVÉ INTERAKCE - především zhášení luminiscence - vliv pH, teploty, viskozity, polarita rozpouštědla Fluorescence a fosforescence MERENI STACIONÁRNÍCH SPEKTER - spektrofluorimetr SPEKTROFLUORIMETR r\ ü ŕ ZDROJ záření excitační monochromator VZOREK EMISNÍ MONOCHROMATOR FLUORESCENČNÍ 'DETEKTOR MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie ■ VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie ■ VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence Fluorescence a fosforescence • MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER -spektrofluorimetr * zdroj záření - xenónová výbojka - nízkotlaká rtuťová výbojka • křemenné kyvety • mřížkové monochromátory • detektor - fotonásobič -excitační a emisní spektra • excitační - změna vlnové délky excitujícího záření konstantní Á emisního toku • emisní - fixovaná Ä excitujícího záření proměnná Á emisního toku Fluorescence a fosforescence • STACIONÁRNÍ SPEKTRA - knihovny spekter • charakteristická spektra polyaromatických uhlovodíků • charakteristická spektra fluorescenčních indikátorů • ČASOVĚ ROZLIŠENÁ SPEKTRA - měření doby života excitovaných stavů • snazší u fosforescence • obtížnější u fluorescence - studium přenosu energie Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie ■ VIDITELNÁ a U V oblast ■ fluorescence a fosforescence - stacionární spektra - pásové spektrum - malý počet širokých pásů - kvantový výtěžek fluorescence - samoabsorpce - zhášení rozpouštědlem či „zhášedly" STANOVENÍ NlZKÝCH OBSAHU PŘEDEVŠJM______ ORGANICKÝCH LÁTEK Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast ■ fluorescence a fosforescence - stacionární spektra PŘÍMÉ METODY - stanovení PAH - stanovení hemoproteinů - stanovení vitamínů - stanovení steroidů Kvantitativní spektrometrie specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast ■ fluorescence a fosforescence - stacionární spektra NEPŘÍMÉ METODY - tvorba chelátů - např. s morinem - stanovení hliníku - stanovení aniontů na principu zhášení fluorescence - stanovení na základě reakce provázené vznikem fluoreskujícího produktu 6 Kvantitativní spektrometrie Klíčový požadavek - vyjádřit VZTAH MEZI KONCENTRACÍ (OBSAHEM) ANALYTU a SPEKTRÁLNÍ VELIČINOU - matematické vyjádření - experimentální kalibrace a validace (externí standardy, metoda standardního přídavku) SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - absorpční metody - emisní metody - rozptylové metody - reflexní metody Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda kalibrační křivky (external standards) - připravíme sérii kalibračních roztoků stanovovaného analytu, pokrývající zamýšlený koncentrační rozsah - snažíme se, aby bylo stejné složení matrice jako u vzorku - předpokládáme, že vliv matrice je zanedbatelný - (když je rozsah koncentrací analytu omezen, vystačíme třeba i s dvěma standardy - „pod" a „nad" vzorky) Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda standardních přídavků (internal standards) - použitelná v případě, že je nemožné potlačit interference matrice - ke změřenému vzorku je přidáno malé množství roztoku standardu a stanovení se opakuje za maximálně možných stejných podmínek - metoda je mnohem náročnější na množství práce, vhodná pro ověření vlivu matrice Metody kalibrace Důležité pojmy * Metoda vnitřního standardu - do všech analyzovaných vzorků i kalibračních (validačních) roztoků je přidáno stejné množství vhodné čisté látky odlišné od analytu - jako kalibrační křivku vynášíme poměr odezvy analyt/standard proti koncentraci anaivtu ve standardních roztocích - vnitřní standard by měla být látka podobná anaivtu, jejíž signál však neinterferuie se signálem analytu Kvantitativní spektrometrie ATOMOVÁ EMISNÍ spek. - emisní metoda ATOMOVÁ ABSORPČNÍ spek. - absorpční metoda MOLEKULOVÁ spek. UV, vis - absorpční metoda, (reflexní metoda) - luminiscence - emisní metoda NIR - absorpce, reflexe MIR, FIR - absorpce, reflexe Raman - rozptyl NMR spektrometrie, hmotnostní spektrometrie Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - pro absorpční metody - absorpce fotonů - závisí na množství excitovatelného analytu DŮLEŽITÉ FAKTORY - vstupní tok záření - tloušťka absorbující vrstvy ■ absorpční koeficient ■ napierovský, dekadický - molární absorpční koeficient - ■ napierovský, dekadický Kvantitativní spektrometrie - vztah k tloušťce vrstvy Bouguer (1729), Lambert (1760) |-d/ = klóx] I d/ | dx = kl Id/ . . I -----= k dx\ \ 1 \ -In 1. \=kb\ V 'o J | Kvantitativní spektrometrie - vztah ke koncentraci Beer (1852) - vyjádření vztahu pro k iáv I = afdekadický absorpční 2303 ^ koeficient , (dekadický) molární absorpční koeficient a= s c -log / A / 0/ = -\ogT = A A = 8 be Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - pro absorpční metody -ABSORBANCE DŮLEŽITÉ FAKTORY - vlnová délka vstupního záření - eliminace jiných optických jevů - rozptyl, odraz, lom, fluorescence... - eliminace saturačního efektu - směs analytů (4i)i=fa)i bci Kvantitativní spektrometrie v r ABSORPČNÍ metody - efekty ovlivňující hodnotu molárního absorpčníh o koeficientu DŮLEŽITÉ FAKTORY závislost na vlnové délce vstupního záření chemické reakce analytu mezimolekulové interakce s rozpouštědlem mezimolekulové interakce s jinými analyty vliv teploty na stabilitu analytu Kvantitativní spektrometrie ABSORPČNÍ METODY - ABSORBANCE - neměříme před a za vzorkem. ale SE VZORKEM a BEZ VZORKU - jednopaprskove a dvoupaprskove uspořádání - pásové spektrum - výška píku - plocha píku - KOREKCE POZADÍ - vlivy matrice, další vlivy Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - emisní metody - emise fotonů - závisí na množství excitovaného analytu EMITOVANÝ ZÁŘIVÝ TOK úměrný KONCENTRACI analytu - celkové množství analytu ve vzorku ■ způsob excitace ■ možnosti nezářivé deexcitace ■ rušivé emisní procesy ■ rušivé absorpční procesy (samoabsorpce) ■ závislost na vlnových délkách Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - reflexní metody - počet odražených fotonů úmérný koncentraci - závisí na množství ozářeného analytu - celkové množství analytu ve vzorku - reflektivita vzorku a dalších materiálů - absorpce záření během odrazu ■ lom dopadajícího záření / totální odraz Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ VELIČINA - rozptylové metody - počet rozptýlen) i fotonů úměrný koncentraci (Ramanův rozptyl, nefelometrie) - zeslabení transmitovaného toku záření (turbidimetrie) - závisí na množství excitovaného (ozářeného) anaiytu - celkové množství anaiytu ve vzorku ■ způsob excitace ■ rušivé emisní procesy - LUMINISCENCE Kvantitativní spektrometrie SPEKTRÁLNÍ DATA vs. KONCENTRACE - kalibrace, validace, měření neznámých vzorků - zpracování dat - regresní metody - postupy kalibrace - sada nezávislých roztoků - metody standardního přídavku - zpracování kalibračních dat -jeden analyt ■ více sledovaných analytů Kvantitativní spektrometrie Zpracování kalibračních dat -jeden analyt - více sledovaných analytů - univariátní a multivariační metody - zpracování úseků spekter či celých spekter - analýza složitých směsí Kvantitativní spektrometrie • CLS - classical least squares • I LS - inverse least squares • MLR - multiple linear regression • (PCA - principal component analysis) • PCR - principal component regression • PLS1 - partial least squares 1 • PLS2 - partial least squares 2 Regrese CLS • klasická metoda nejmenších čtverců - „K-matrix" • předpoklad platnosti Lambertova - Beerova zákona při všech vlnových délkách (frekvencích) - absorbance ie funkcí koncentrace » chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení absorbancí • použitelná i pro celá spektra • všechny komponenty musí být známy a zahrnuty do kalibrace Regrese I LS • inverzní metoda nejmenších čtverců - „P-matrix" • předpoklad platnosti inverzního Lambertova - Beerova zákona pro všechny koncentrace -koncentrace ie funkcí absorbance • chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení koncentrací • použitelná pro omezený počet vlnových délek • komponenty nezávislé, postačuje znalost jedné složky v kalibračních smésích Regrese P LS ortogonální transformace dat do systému souřadnic označovaného jako hlavní komponenty - PC - redukce počtu potřebných souřadnic PLSR scores PC2 * * PC1 ©■ 4t ***** 100% A i"1 *"*^ ** * + ** *; *, * ******* * * * * 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Wavenumber [cm-1] 100% B + * * ŕ + * * * * * * i__x * * * * * * * * * * w * * * * * * T * 1 * * * + * * * t í * * 1 Ti * í * * t * í * * * i í í *0 100% C