GLP v biologii - syllabus
GLP v biologii ­ základy QA/QC
Přehled aplikací a postupů vyžadujících GLP + příkladová studie
Vybraná témata detailněji:
Léčiva a jejich regulace
Zajištění zdraví člověka (a zajištění parametrů kvality)
Bezpečnost látek pro člověka - toxikologické studie
Laboratorní a pokusná zvířata
Bezpečnost látek pro prostředí - ekotoxikologie
Alternativní testovací systémy
Problematika GMO
GLP v biologii - úvod
* BIOLOGIE ­ experimentální věda vs. Praktická
biologie/biochemie/mikrobiologie atd.
* Nutnost dodržovat GLP zejména,když výsledky jsou využity
při rozhodování
= Praktická biologie a biochemie
­ Léčiva (registrace/povolení, výroba, kontrola, přípravy...)
­ Lékařská biologie a biochemie
­ Mikrobiologická kvalita (potraviny, pitná voda)
­ Průmyslové chemické látky, potravní aditiva, potenciálně nebezpečné
agens (geneticky modifikované organismy) .. a jejich bezpečnost =
toxikologie, ekotoxikologie, biodegradabilita,
­ Další zákonem dané oblasti ve vztahu k biologii ­ dodržení etických
požadavků (např. práce se zvířaty/obratlovci)
GLP v biologii ­ základní principy a
příkladová STUDIE
* V Biologii platí stejné principy jako pro
chemické analýzy (viz předchozí přednášky QA/QC,
detailní SOPs, dokumentace ...)
* Příklad - ,,jednoduché" STUDIE v režimu GLP
Příkladová STUDIE (viz příloha)
* Cíl studie:
* Podkladový materiál pro registraci (povolení) využití aspirinu u prasat
* Jeden z dílčích podkladových materiálů - popis farmakokinetiky aspirinu u
prasat po jednorázovém podání (příklad)
* Experimentální design:
* 8 zvířat (prasat), jednorázová aplikace aspirinu
* odběry krve v definovaných časech (0-144 h)
* sledování hladin metabolitů K. AcSal a vyhodnocení
* Realizace:
* 1) Plán projektu (100 stran + přílohy SOPs)
* 2) Výstup ­ Zpráva z realizace (detailní dokumentace vč. Veškerých
odchylek)
* Přímá ­ jmenovitá ­ odpovědnost konkrétních osob ... atd.
GLP v biologii 1 ­ Léčiva
GLP v biologii 1 ­ Léčiva
* GLP & přesná dokumentace vyžadována u
humánních i veterinárních léčiv:
­ Registrace před použitím
* průkaz a dokumentace farmakokinetiky, cílové aktivity ve
srovnání s existujícími postupy, bezpečnost pro lidi + nově i
pro životní prostředí ...
­ Dokumentace celého životního cyklu - výroba, přípravy v
lékárnách, kontrola kvality, aplikace, reporting vedlejších účinků,
likvidace (nebezpečný odpad)
­ Státní autority:
* SÚKL (Státní úřad pro kontrolu léčiv)
* ÚSKVBL (Ústav pro státní kontrolu veterinárních
biopreparátů a léčiv)
GLP v biologii 1 ­ Léčiva
* Základní zákonný dokument:
* Český lékopis
(viz příklad: ke zkoušce znát vnitřní strukturu a základní obsah)
* Aktuální Č.L.: Vyhl. MZd ČR č. 180 / 2002
* Požadavky na jakost, postup při přípravě,
zkoušení, uchovávání a dávkování léčiv
* Řada dalších dílčích norem
(např. požadavky na přípravy/nakládání s cytotoxickými léčivy =
vedlejší karcinogenní účinky ...)
GLP v biologii 2
­ ochrana (zdraví) člověka -
GLP v biologii 2 ­ zdraví člověka
* Zdraví člověka ovlivňuje řada faktorů, jejichž KVALITA musí
být kontrolována (státem) a GLP hraje významnou roli:
- potraviny, pitná voda, rekreační voda, vnější ovzduší, pracovní
ovzduší, hlučnost ... (+léčiva)
- zdravotní péče (vyšetření, analýzy ... správná lékařská praxe)
* Zajištění kvality = Autority­ Ministerstva (MZe, MZd, MŽP) a
zřizované ústavy (řada překryvů v kompetencích)
­ Státní zdravotní ústav
­ Zdravotní ústavy (zpr. krajské)
­ Hygienické stanice
­ Státní veterinární správa
GLP v biologii 2 ­ zdraví člověka
* Pro každou kategorii, tj.:
­ Potraviny, Pitná voda, Rekreační voda, Ovzduší
­ Zdravotní péče
definovány různé požadavky na kvalitu
* Chemické rozbory - limity pro vybrané toxické látky (různé druhy potravin,
různé limity): toxické kovy ­ př. Hg, toxiny plísní, persistentní látky
(polychlorované bifenyly, dioxiny), pesticidy, nepovolené náhražky
* Mikrobiologická bezpečnost (kultivace nebo jiný průkaz patogenů - např.
metody molekulární biologie - Listerie)
* Specifické požadavky (např. prašnost ­ např. limity pro PM10 = particulate
matter >10micrometrů, hlučnost ...)
* Lékařská vyšetření a analýzy (např. průkaz rakovinných biomarkerů,
těhotenství, přítomnost HIV ...)
GLP v biologii 3
Využití obratlovců jako modelů v biologii
GLP v biologii 3 ­ MODELY v biologii
* Existuje mnoho přístupů v biologii
(řada musí být využívána při hodnocení
,,bezpečnosti" pro zdraví člověka ­ viz předchozí
diskuze ­ léčiva, bezpečnost chemických látek ...)
* Obratlovci:
­ in vivo (zvířata)
­ ex vivo (orgány zvířat)
­ in vitro (buňky, buněčné linie)
* Bezobratlí
* Rostliny
* Bakterie
Využití zvířat (=obratlovců)
­ zvláštní případ (etické aspekty...)
* Právní rámec ­ nutnost regulace
­ Zákon na ochranu zvířat proti týrání 246/1992
­ Vyhláška 311/1997 (o využití pokusných zvířat)
* Zákon + vyhláška definuje:
­ CO je zvíře (!! OBRATLOVEC, kromě embryí a plodu)
* typy zvířat, laboratorní / pokusné ...
­ KDO a KDY smí zvířata využívat (jakékoliv užití zvířat!)
* Vyžaduje se registrace ÚKOZ (MZe)
­ JAK lze experimenty realizovat (dodržování pravidel GLP)
* projekt pokusu
* protokol pokusu, evidence
Význam využití zvířat (obratlovců,
savců / pokusných zvířat)
* Unikátní 3D prostorové uspořádání
* Fyziologické a Farmako(Toxo)kinetické procesy (podobné s
člověkem)
* Lze pozorovat komplexní účinky (podobné s člověkem)
* Mnoho látek má více mechanismů toxického efektu
* Z těchto a dalších důvodů - nutno testovat in vivo
­ Účinnost léčiv (vč. Vedlejších účinků)
­ Bezpečnost kosmetických přípravků
­ Toxicita chemických látek pro člověka
LEGISLATIVA EU
,,REACH"
Zákon stanoví - kdy lze zvířat využít
­ výroba, vývoj, kontrola kvality, nezávadnosti a účinnosti
léčiv, biopreparátů, potravin a event. jiných výrobků
­ studium nemocí, prevence, diagnostika, léčení
­ studium fyziologických procesů
­ ochrana životního prostředí
­ výuka na SŠ a VŠ
Zákon stanoví - kdy se zkoušení vyžaduje
OCHRANA ČLOVĚKA a HOSP. ZVÍŘAT
potraviny, zemědělské látky
kontrola léčiv
výroba léčiv - farmakologické preklinické studie
farmakokinetika
nežádoucí účinky
toxicita (akutní, chronická)
mutagenita, kancerogenita
reprodukční toxicita
GLP 4
Bezpečnost chemických látek - úvod
Jsou nebezpečné/toxické látky
regulovány ?
* Do nedávna ­ neexistovala povinnost průmyslu
prokazovat bezpečnost chemikálií
* Existovala řada různých (často protichůdných)
regulací
* Současnost
­ EU = sjednocení ­ nová legislativa REACH
­ USA, Japonsko, Canada atd. ­ podobný vývoj
* Pro zvláštní případy stále existují specifické
direktivy (např. pesticidy ...)
REGULACE chem. látek v EU
* Evropská unie - ECHA (European Chemical Agency)
* REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of
Chemicals)
EU toekomst: REACH
REACH (Registration, Evaluation and
Authorisation of Chemicals)
* Všechny chemikálie vyráběné nebo dovážené do EU
musí být registrovány, zhodnoceny (testovány) a
autorizovány (náklady nese průmysl)
* Hodnocení rizik ­ cca 30000 chemikálií
­ harmonogram dle důležitosti (nejdříve HVP - High Volume
Production chemicals > 1000 t/rok, postupně ostatní
* Hodnocené parametry
­ Fyz.chemi. vlastnosti + degradabilita, persistence
­ Toxicita pro člověka
­ Nebezpečnost pro prostředí - ekotoxicita
REACH EU
předp. počty testovaných chemikálií
REACH EU
předp. náklady na testování
GLP 4
Bezpečnost chemických látek pro
člověka
(toxicita, karcinogenita / lab. zvířata)
Které látky jsou toxické ?
* Každá látka je toxická, záleží jen na DÁVCE a DOBĚ
PODÁNÍ (expozice)
­ Krátkodobá (akutní) expozice
-> akutní rychlé účinky (smrt)
­ Dlouhodobá (chronická) expozice
-> problematičtější efekty (nemoci, nádory, imunotoxicita,
reprodukční toxicita ...)
* Hodnocení a srovnání toxicity:
­ nejč. LD50 (letální dávka 50) ­ dávka, která s největší
pravděpodobností způsobí smrt 50% exponovaných jedinců
(vyjádření jako koncentrace ­ např. mg/kg živé váhy)
­ další parametry ,,bezpečnosti" ­ např. TDI ­tolerovatelný
denní příjem (např. mg/kg živé váhy/den)
AKUTNÍ TOXICITA
perorální podání ­ lab. zvíře:potkan
CHRONICKÁ TOXICITA
* Vyšetření méně specifických efektů při dlouhodobém (opakovaném)
podávání
* Dávka se odvozuje z akutní toxicity
(nejvyšší koncentrace ~ LD50, dále 10x a 50x nižší)
* Délka studie závisí na ,,předpokládaném" schématu podávání látky (př.
Léčivo 2x denně, 3 měsíce ...)
předpokládané délka studie
* 1-2 d/wk 2 wks
* 1,2,3 ...7 d 4 wks
* Opak 1-30 d 4 months
* Opak > 30 d 6 months
* Složitý design a řada požadavků
­ Zvířata (více druhů, stáří, pohlaví...), počty ve skupině
* Vyhodnocení - pitva (definované úkony), statistika ...
* Ekonomická náročnost , etické problémy ... GLP!
REPRODUKČNÍ TOXICITA
* Zjišťuje se vliv na
­ sexuální chování zvířat
­ prenatální mortalitu
­ fetální abnormality & poškození během života
* Experimenty
­ změny fertility, vliv na F a M gamety (poměry narozených
F a M); toxicita pro embrya a féty, změny gravidity
ovlivňující fety, vliv na růst a vývoj dělohy a placenty,
porod, postnatální vývoj a laktaci matky, vliv na potomstvo
(schopnost učení)
* Složitý design a náročné vyhodnocení ­ viz chronická
toxicita
HODNOCENÍ KANCEROGENITY
* Mutagenní a genotoxické látky ­ zpravidla považovány za
karcinogenní
­ Rakovina ­ velký problém pro západní civilizaci
­ Oproti jiným toxickým látkám - karcinogeny jsou považovány za
,,bezprahově působící"
* Neexistuje bezpečná dávka (i jedna molekula může vyvolat efekt)
* Experimentální průkaz karcinogenity ­ nejnáročnější studie
(celoživotní expozice, stovky zvířat v experimentu ...)
­ POZOR - ne vždy však existují korelace výsledků - zvíře vs. člověk (!)
* Řada klasifikačních schémat chemických látek
­ WHO (Světová zdravotnická organizace)
­ IARC - Intern. Agency for Research of Cancer
KLASIFIKACE IARC
* Group 1: The agent (mixture) is carcinogenic to humans.
* Group 2
­ Group 2A: The agent (mixture) is probably carcinogenic to humans.
­ Group 2B: The agent (mixture) is possibly carcinogenic to humans.
* Group 3: The agent (mixture or exposure circumstance) is not
classifiable as to its carcinogenicity to humans.
* Group 4: The agent (mixture) is probably not carcinogenic to
humans.
GLP 5
Bezpečnost chemických látek pro
prostředí
= ekotoxikologie
Ekotoxikologie
* Věda s řadou aplikací, jejímž cílem je racionálně chránit EKOSYSTÉM,
populace a společenstva organismů
(na rozdíl o toxikologie ­ předmětem je ochrana jednoho druhu = člověk)
* Ekosystém ­ složitá struktura a funkce bioty
* Nutná je ochrana všech stupňů (trofické úrovně)
­ Producenti (řasy, rostliny ...)
­ Konzumenti různých řádů (bezobratlí, obratlovci)
­ Destruenti (mikroorganismy)
* Nelze otestovat účinky na všechny druhy
­ existují ,,modely" = zástupci významných skupin (trofických stupňů)
* Hodnocení ekotoxicity ­ podobné principy jako toxikologie
­ LC50 (letální koncentrace 50), EC50 (efektivní koncentrace 50 ­ např. reprodukční
toxicita)
- NOEC ­ bezpečná hladina (,,no observed effect concentration"
Řasové testy toxicity
Řasy
Selenastrum capricornutum
Scenendesmus subcapitatus
Sc. quadricauda
Chlorella vulgaris
Příklady modelů ­ Ekotoxikologické biotesty
-Producenti
- ve vodě
- v půdním prostředí
Toxicita pro rostliny
- zpravidla zástupci jednoděložných i dvouděložných (více
druhů)
Daphnia magna
Artemia salina
Ceriodaphnia dubia
Gammarus Chironomus riparius
Příklady - Ekotoxikologické biotesty
- Konzumenti ­ bezobratlí ­ vodní prostředí
Živorodka duhová (Paví očko), Poecilia reticulata Danio rerio (syn. Brachydanio rerio)
Karas (zlatá forma)
Pimephales promelas
Pstruh
Příklady - Ekotoxikologické biotesty
- Konzumenti ­ obratlovci ­ vodní prostředí
BAKTERIE ­ významný model v
testování
* Snadná kultivace, krátký generační čas, jednoduché uspořádání
(jediná membrána), jednoduchý genetický aparát
* Využití při testování ,,bezpečnosti" látek (i jiných vzorků ­ extrakty
z potravin ...)
­ rychlé (skríningové) testy akutní toxicity (MICROTOX)
­ genotoxicita - jednoduché sledování poškození DNA:
Amesův test
TEST AKUTNÍ TOXICITY - MICROTOX
- mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri
- krátkodobá expozice testované látce (5-30 min)
- sledování změn přirozené luminiscence ­ odpovídá toxicitě
- uspořádání:
kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru
Mikrobiální ekotoxikologické biotesty
- Test na reverzní mutace se Salmonella typhimurium
-Původní kmen neroste na živném médiu
- Látka vyvolá (reverzní) mutaci -> bakterie rostou
Amesův test
Jaké testy se reálně užívají?
Existují alternativy k in vivo testům ?
ALTERNATIVNÍ METODY
Standardizace v biologii
vs. alternativy
Možnosti využití různých modelů v biologii
­ Obratlovci ­ tj. in vivo (celá zvířata)
* Řada etických a praktických (finančních) limitací
­ Náhrada in vivo experimentů - koncept "3R"
* Reduction (Snižování),
* Refinement (Zmírňování),
* Replacement (Nahrazování)
­ Alternativní metody
* ex vivo (orgány zvířat)
* in vitro (buňky, buněčné linie, enzymy ...)
Výhody alternativních metod
­ snižování počtů zvířat
­ mechanistické metody ("dioxinová" toxicita)
­ rychlejší, levnější, možnost hodnocení více vzorků
Standardní metody
* V odborné literatuře - velké množství experimentálních metod
* Méně metod je standardizovaných a validovaných:
* STANDARDIZACE metod ­ výsledky akceptovatelné mezi
státy ­ snižování nákladů / omezení opakovaných hodnocení
* Přejímání standardizovaných metod do legislativ
­ např. ČR ­ Vyhl. 433/2004 Sb. ­ Metody testování toxicity (vychází z
OECD guidelines)
* Standardizační agentury:
OECD.org (! Velký význam ­ viz úvod do GLP/chemie)
ISO.org
USA - ASTM.org
5 hlavních sekcí ­ v rámci každé ,,stanardizované postupy"
Section 1: Physical Chemical Properties
Section 2: Effects on Biotic Systems (16 postupů)
Section 3: Degradation and Accumulation (8 postupů)
Section 4: Health Effects (86 postupů)
Section 5: Special Activities
OECD GUIDELINES ­ Chemicals Testing
www.oecd.org
Toxicita
pro člověka:
86 postupů
Alternativní metody
* Mezinárodní agentury pro validaci alternativních
postupů (cílem je ,,3R")
­ ICVAM (USA)
­ EU: ecvam.jrc.it
* ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods)
* Časopis ATLA (Alternatives to Laboratory Animals)
* Kompletní návody na validované postupy (tedy
ověřené), které splňují 3R, ale nejsou zatím
registrovány standardizačními agenturami
in vitro buněčné techniky
další příklady - "alternativní"
techniky
* Embrya a plody
(ze zákona nejsou považovány za ,,zvíře")
­ CHEST Chick Embryotoxicity Screening Test
­ FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay
Xenopus (validovaná alternativa testů teratogenity)
Problematika regulace
Geneticky Modifikovaných
Organismů (GMO)
GMO v ČR
* Zákon 153/2000
* Vyhlášky 372, 373, 374/2000 MŽP
* Definice:
­ Organismus
* biologická jednotka (buněčná nebo nebuněčná) schopná
rozmnožování nebo přenosu dědič. materiálu včetně virů
....
­ GMO
* organismus (kromě člověka) změněný gen. modifikací
Genetická modifikace - zákon
* Co je Genetická modifikace: ?
­ rekombinantní techniky vytvářející nové kombinace DNA - vložení
nového úseku jakýmkoliv způsobem do NK, plazmidu, vektoru ...
­ techniky zavádějící děd. materiál připravený mimo organismus do
organismu (mikroinjekce, mikroenkapsulace ...)
­ techniky buněčné fúze, hybridizace buněk (!produkce monoklonálních
protilátek)
* Co není Genetická modifikace?
­ oplození in vitro
­ bakteriální konjugace a všechny podobné přirozené procesy
­ indukce polyploidie a haploidie
­ mutageneze
­ křížení
Proč regulovat GMO ?
* Předběžná opatrnost
­ stále málo prostudováno
­ neznáme možné důsledky vnášení do prostředí, například:
* přímé nebo nepřímé škodlivé působení na člověka, zvířata, rostliny
 onemocnění (GM bakterie)
 alergizace, toxicita
* vliv na dynamiku populací a genetickou rozmanitost
* omezení možnosti léčby (rezistence vůči ATB)
* účinky na biogeochemické procesy (fixace dusíku, koloběh uhlíku
...)
* Pro každý GMO je třeba zpracovat Analýzu Rizika
­ detailní posouzení škodlivých účinků a jejich míry
Schema regulace GMO
* Ministerstvo ŽP registruje:
­ seznamy uživatelů (právnické osoby)
­ seznamy GMO pro uzavřené nakládání
­ seznamy GMO pro vnášení do prostředí
­ seznamy GMO pro vnášení do oběhu
* Uživatel
­ registrace a žádost o zápis do příslušného seznamu
* Další orgány
­ ČIŽP, celní orgány, orgány veterinární správy, ÚKSÚZ,
SZÚ, ÚSKVBL, ČZPI
Povinnosti uživatele
* REGISTRACE
­ Složitá forma žádosti - řada požadavků (př. přesná
definice genetické změny pro účely identifikace...)
­ Pověřené osoby (vzdělání, praxe ...)
­ Odborný poradce
* Před zápisem do seznamu je nutné provedení
analýzy rizika a kategorizace - popis
náležitostí je ve vyhlášce
Analýza rizika GMO - 4 kategorie
* A - bez rizika nebo s min. rizikem škodlivého působení
* B - riziko, které může být odstraněno obecně známými
opatřeními
* C - riziko, které může být odstraněno jen zvláštními náročnými
zásahy
* D - riziko, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela
odstraněno
* Podle kategorie rizika je nutno zabezpečit provoz zařízení
­ vybavení
­ provozní řád
* identifikace, osoby, seznam a popis pracovních postupů, výčet GMO a
jejich počet, zásady vedení evidence o provádění sanitace, hygiena, vedení
dokumentace ...
* opatření pro případ havárie - speciální havarijní plán
Nakládání s GMO ­ důkladná
dokumentace
* PLÁN ETAPY
­ účel, údaje o organismu, osoby, specifikace materiálu, postupy
nakládání, likvidace, odpady
­ schválení odborným poradcem
* Provozní deník (každý zápis s podpisem)
­ plán etapy, průběh etapy
­ primární údaje (!)
­ zápisy o kontrolách
* Závěrečná zpráva etapy
* Průběžná archivace a reporting -> MŽP