Srážecí metody Srážení • Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu [• ]První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH[4])[2]SO[4] • Filtrace nahrazena centrifugací Rozpustnost bílkoviny • Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny Rozpustnost bílkoviny • Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota Izoelektrická precipitace Srážení neutrálními solemi Vsolování Vysolování Praktické aspekty • Hofmeistrova řada Anionty SCN^-, J^-, ClO[4]^-, NO[3]^-, Br^-, Cl^-, Ac^-, SO[4]^2-, PO[4]^3- Kationty Na^+, K^+, NH[4]^+ (NH[4])[2]SO[4] • Rozpustnost se málo mění s teplotou • Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm^3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm^3) • Levný • Stabilizuje bílkoviny • Relativně čistý Srážení - dvojstupňově Přidané množství • Tabulky • Vzorce Provedení Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou • Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny Výběr rozpouštědla • Kompletně mísitelné s vodou • Nereaguje s bílkovinou • Musí mít dobrý precipitační efekt EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou • COHN – separace plazmatických bílkovin EtOH • Nutno provádět při T < 0 ^oC, při větší teplotě dochází k denaturaci • Dvojstupňově • Přídavky z tabulky nebo podle vzorce Srážení org.polymery Princip identický s rozpouštědly • DEAE dextran • PEG • Polyakrylová kyselina • Rivanol • Kaprylová kyselina Srážení selektivní denaturací • Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z 85 - 90 % v nativním stavu. • Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla • Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat Tepelná denaturace Tepelná denaturace • Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost – denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů • Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin • pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno • Při vyšší teplotě běží více proteolýza pH denaturace • Provádět za definované teploty • Změny pH dělat co nejrychleji • Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady pH 5 HAc pH 8 Tris pH 4 k.mléčná pH 9 DEA pH 2 H[3]PO[4], H[2]SO[4] pH 11 NaOH • Extrémy pH – bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu ® nutná zpětná úprava pH Denaturace org.rozpouštědly • Pří srážení organickými rozpouštědly – T < 0 ^oC • Pří denaturaci organickými rozpouštědly – T = 20 – 30 ^oC • Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv • T a pH musí být přesně definovány EtOH, MetOH, aceton