Elektromigrační metody Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“ Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Vesterberg, Svensson • - kapilární elektroforéza v rotující 1 - 3 mm křemenné kapiláře Hjerten 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975 - 2D-elektroforéza O´Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers Teoretické aspekty elektromigračních metod Mobilita Elektrická síla F[e] Sekundární jevy • Jouleovo teplo • Elektroosmóza Jouleovo teplo Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok Původ elektroosmotického toku Elektroforéza „Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“ Elektroforéza • Volná • Zónová Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Stabilizace • Rotací • Gradienty hustoty • Porézními medii • Kapilárou Požadavky na porézní media • Homogenita • Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF • Reprodukovatelná a snadná příprava • Mechanická pevnost • transparentnost Upořádání Upořádání Chromatografický papír Složení – celulosa - Nehomogenní - Přítomnost ionogenních skupin - Špatně se chladí – pálí se Použití : téměř už se nepoužívá Agar a agarosa Složení – kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy - Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK Acetát celulosy Složení – acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití : imunoelektroforetické metody klinické aplikace Škrob Složení – hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta - Špatné mechanické vlastnosti - Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava - Není transparetní Použití : izoenzymová analýza Sypané vrstvy Složení – Sephadex – zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní Polyakrylamid Složení – kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky - Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin Polyakrylamid Polyakrylamid - příprava Radikálová polymerace • Katalyzátor – tetramethylethylendiamin TEMED • Iniciátor - chemicky – (NH[4])[2]S[2]O[8] - fotochemicky – ribloflavin + UV Polyakrylamid - složení Provedení PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientové kontinuální x diskontinuální Provedení PAGE Provedení PAGE Diskontinuální PAGE Orstein, Davis SDS PAGE SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy Použití SDS PAGE • Stanovení Mr • Analýza komplexních směsí • Sledování purifikace bílkovin • Stanovení podjednotkového složení PAGE - sekvenace DNA Izotachoforéza „Vzorek je umístěn mezi dva elektrolyty : vedoucí L (leading) s nejvyšší mobilitou a - uzavírající T (terminating) s nejmenší mobilitou“ Izotachoforéza Izotachoforéza Izotachoforéza Kohlrauschova regulační funkce Analytická ITP Analytická ITP instrumentace • Napájení - stejnosměrné 30 kV 0,2 – 0,5mA • Kapilára 0,1 – 2 mm • Dávkování - dávkovací ventil • Detekce - universální – konduktometrická – potencialně gradientová - selektivní – UV-VIS Analytická ITP Metoda spojování kapilár Izotachoforetický záznam kvantita Izotachoforetický záznam kvalita Preparativní ITP Preparativní ITP Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci Nespecifická detekce Nespecifická detekce Nespecifická detekce Fluorescenční detekce Specifická detekce Autoradiografie Specifická detekce Detekce glykoproteinů Detekce na základě biologické aktivity Detekce na základě biologické aktivity