7. Detekce polymorfizmu TaqI A genu pro DRD2

Úvod

ADHD (porucha pozornosti/hyperkinetický syndrom) je multifaktoriální onemocnění podmíněné různými
kandidátními geny. Hyperkinetický syndrom se vyskytuje asi u 6-10% dětské populace v poměru chlapců
a dívek 3 až 10:1 (dle diagnostických kritérií). K základním symptomům patří nadměrná aktivita,
nepozornost a impulzivita, výjimkou nejsou ani další přidružené psychické poruchy.

Pro pochopení multifaktoriální etiologie ADHD a komorbidních poruch je potřebné odhalit co

největší počet genů, které se podílí na vzniku, vývoji a závažnosti onemocnění a identifikovat
funkční polymorfismy asociované s fenotypem. V současné době je známo více než 30 genů různých
polygenních systémů podílejících se na vzniku a vývoji onemocnění. Jednotlivé alely těchto genů
mohou být v populaci relativně časté, protože nepředstavují klasické mutace, které vyřazují gen z
funkce, ale polymorfismy, které jsou příčinou arteficiální aktivity produktu ať už jde o
transkripci, translaci či o dysbalanci různých isoforem výsledného proteinu.
Výzkum se zaměřuje především na geny kodující jednotlivé proteinové složky dopaminergního systému,
protože některé struktury, zahrnuté do patogeneze ADHD, jsou bohaté na dopaminovou inervaci.
Vyšetřuje se souvislost mezi poruchou pozornosti/hyperaktivním syndromem a polymorfismy v genech
pro dopaminové receptory (DRD2, DRD3, DRD4 a DRD5), dopaminový transportét (DAT1),
dopamin-b-hydroxylázu (DBH), enzym, zapojený do metabolizmu dopaminu, a serotoninový transportér
(5-HTT). Sleduje se přítomnost rizikových alel, hodnotí se vliv těchto rizikových alel a kombinaci
vlivů alel vzájemně interagujících genů na vývoj a závažnost onemocnění a výskyt dalších
komorbidit. Studium jednotlivých transmiterových systémů, které jsou do patogeneze ADHD zapojeny,
může v budoucnosti pomoci při volbě vhodného psychofarmaka vzhledem k tomu, že v léčbě
hyperkinetické poruchy se uplatňují látky s různým mechanismem účinku.

Byla prokázána souvislost mezi TaqI A1 polymorfismem (nosiči rizikové alely TaqI A1 v genu DRD2) a
ADHD, kdy homozygoti pro tuto rizikovou alelu se vyskytují s výrazně vyšší frekvencí  postižených
dětí.

Reagencie:

voda

pufr

primer DO-1

primer DO2

dNTP

polymeráza

vzorek DNA


Amplifikace fragmentů:

-          Do mikrozkumavky napipetujte 24 μl mixu a 1 μl DNA.

-          Mikrozkumavky vložte do termocykleru. Amplifikace bude probíhat dle následujícího
programu:

       94°C – 2,5 min.                    94°C – 30 sek.                      94°C – 30 sek.

      1x   62°C – 30 sek.           32x     62°C – 30 sek.            1x      62°C – 30 sek.

                   72°C – 30 sek.                      72°C – 30 sek.                      72°C – 5
min.


Restrikční analýza:

-          Do mikrozkumavky napipetujte 1 μl TaqI pufru, 10 μl amplifikátu a 0,8 μl enzymu TaqI.

-          Nechte inkubovat 5h při 65°C.


Gelová elektroforéza:

-          Amplifikáty poté naneste na připravený 2% agarózový gel v elektroforetické vaně. Vanu
připojte ke zdroji elektrického napětí a nechte proběhnout elektroforézu cca 60 minut při 80 V.

-          Poté vyjměte gel z elektroforetické vany a vložte jej do transiluminátoru ke konečnému
vyhodnocení.