7. Detekce polymorfizmu A118G (Asn40Asp) genu pro µ-opioidní receptor pomocí RealTime PCR.


Úvod

Opioidní systém v mozku zprostředkovává řadu funkcí v různých jeho částech. Opioidní látky mohou
být původu endogenního či exogenního, jejichž biologické účinky jsou zprostředkovávány receptory µ
(mí), δ (delta) a κ (kappa). Endogenní (tělu vlastní) opioidy jako jsou endorfiny, enkefaliny a
dynorfiny mají analgetické účinky a jsou důležitou součástí odměňovacího systému. Exogenní opioidy
mohou také vedle analgetických a uklidňujících účinků působit silně euforicky (drogy), mohou
způsobovat nevolnost nebo narušovat kognitivní (poznávací) funkce. Opioidní systém se významně
podílí na modulaci emocí, úzkosti, stresu, učení, paměti. Mimoto se účastní i modulace funkcí
imunitního systému (Börner et al., 2007). PET studie (pozitron emisní tomografie) postmortem,
prokázaly nejvyšší hustotu µ-receptorů v kortexu cingula, v thalamu, periaqueduktální oblasti a
nucleus caudatus. Stimulace těchto receptorů vede k aktivaci dalších neurotrasmiterových systémů
jako jsou cholinergní, adrenergní a dopaminergní (Leppä et al., 2006).

Opioidní systém byl dosud zkoumán především z hlediska jeho analgetických účinků a mechanizmů
vyvolávajících euforické stavy u drogově závislých. Drakenberg et al. (2006) nalezl téměř 90 %
výskyt genotypu A/G polymorfizmu A118G genu pro µ-receptor u závislých na heroinu. Alela G
zapříčiňuje snížení exprese µ-receptoru, jak na úrovni transkripce, tak na úrovni translace. Změny
se týkaly zejména mRNA pro prekurzor enkefalinu, jejíž snížení bylo patrné v celé oblasti striata
závislých na heroinu, což má celkový vliv na limbický a motorický systém. Vzhledem k četným
interakcím a značné provázanosti opioidního systému s dalšími neurotransmiterovými systémy,
obzvláště s dopaminergním, se začíná zkoumat jeho případná role v patogenezi nejrůznějších
duševních chorob. U schizofrenie byla nalezena významná asociace s alelou G genu pro µ-opioidní
receptor. Alela G snižuje expresi µ-opioidního receptoru, čímž může v průběhu vývoje mozku
negativně zasáhnout do myelinizace kortikálních axonů a ovlivnit tak vznik hyperaktivity
dopaminového systému typického pro schizofrenii (Šerý et al., 2009).





Popis polymorfizmu: jedná se o jednobodový polymorfizmus, kdy v pozici 118 nukleotidové sekvence
alternuje Adenin s Guaninem resp. v pozici 40 proteinové sekvence Asparagin (Asn) s kyselinou
Asparagovou.


Reagencie:


Primery

-         MU1 5´- CAC GAA CGC CAG CAA TTG - 3´

-         MU2 5´- TGA TCG TGA TGG CCG TGA T - 3´


Sondy

-       A  (Asn alela): název SMUA (3´- Eclipse a 5´- Yakima Yellow)

sekvence 5´- CA CTT AGA TGG CAA CCT GTC CGA CCC A - 3´


-       G (Asp alela): název SMUG (3´- Eclipse a 5´- FAM)

sekvence 5´- CC CAC TTA GAT GGC GAC CTG TCC GA - 3´



Reakční směs (25 ml):


-       12,5 ml TaqManUniversal PCR Master Mix


-            1 mM každého z primerů (0,5 ml)


-            0,125 mM sondy SMUA (0,5 ml)


-            0,075 mM sondy SMUG (0,3 ml)


-            100 ng genomové DNA (2 ml)



Reakce i detekce je prováděna pomocí automatizovaného systému PCR-Real Time AB7300.


Amplifikace:

-       počáteční denaturace – 2 minuty při 50°C a 10 minut při 95°C


                       20 sec  – 95°C (denaturace)

          35x        20 sec  – 58°C (annealing)

                       32 sec  – 72°C (extenze)


Odlišné genotypy (AA, AG, GG) budou detekovány díky navázaným sondám na základě jejich
fluorescence.