Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS-PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 1 Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS-PAGE a Western blot analýzy TEORETICKÝ ÚVOD SDS-PAGE je velmi efektivní analytická pomůcka pro separaci proteinové směsi, k analýze čistoty proteinu a jeho přibližné molekulové hmotnosti, ale neposkytuje nám žádná data na základě, kterých bychom mohli provést identifikaci nabarveného proteinu. Barvení stříbrem nebo coomasie nám poskytuje pouze důkaz o přítomnosti molekulové hmotnosti proteinu. Při provádění podrobnějších analýz separovaných proteinů se obvykle setkáváme s problémem málo přístupné a husté matrice polyakrylamidového gelu pro celou řadu detekčních činidel. Proteiny z SDS-PAGE gelu tak mohou být přeneseny (přeblotovány) z gelu na tenkou matrici (blotovací membránu), na které jsou daleko více přístupné pro chemická činidla nebo biochemické reagencie. Pokud je přenos proteinů spojen s vysoce specifickou a citlivou detekcí pomocí imunometod, je tento proces nazýván WesternBlottingem. Western blotting má celou řadu výhod zahrnující malou spotřebu reagencií, krátký čas zpracování, nenáročné vybavení a velmi vysokou efektivitu. V současné době se používají tři základní blotovací matrice: nitrocelulosová, nylonová a PVDF (polyvinyldifluoridová). Vazba proteinů na metrice je ne-kovalentní, kdy k nejsilnější interakci dochází u PVDF membrány. Ze všech typů membrán se potom PVDF membrána vyznačuje největší pevností a velmi nízkým pozadím při barvení. Pro přenos proteinů z gelu na membránu využijeme metodu semi-dry elektroblottingu, kdy je gel s membránou umístěn mezi dvě elektrody a dochází k přenosu proteinů pomocí aplikovaného elektrického pole. K vlastní detekci proteinů na membráně se při imunodetekci používají většinou dvě protilátky. Primární protilátka je specifická pro náš protein zájmu. Druhá, sekundární, protilátka je většinou protilátka proti IgG protilátce použité v prvním kroku a je konjugována s enzymem, nejčastěji křenovou peroxidasou nebo alkalickou fosfatasou. Pokud se poté přidá k membráně detekční roztok, enzym konjugovaný se sekundární protilátkou katalyzuje barevnou reakci dávající barevný proužek na membráně. V našem případě budou použity dvě varianty detekce. První varianta bude levnější možností detekce, kdy specifická skupina proteinů, glykoproteiny, bude identifikována pomocí lektinů, které se specificky váží na cukerné zbytky. Lektiny jsou třídou proteinů vyskytujících se u bakerií a rostlin schopné vázat se na cukerné zbytky glykoproteinů. V našem experimentu použijeme lektin z fazole Konkavalin A (Con A), který má velmi vysokou afinit k a-D-manosylovým zbytkům. Tento Con A je konugován s křenovou peroxidasou, která poskytne po přidání substrátu 4-chloro-1naftolu/peroxidu vodíku barvenou reakci. Při druhé variantě bude použita polyklonální protilátka proti lidským IgG protilátkám (specifická k -řetězci) konjugovaná s křenovou peroxidasou. Jako vzorek bude použito lidské sérum Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS-PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 2 POSTUP PRÁCE SDS-PAGE elektroforéza Roztoky: Proteinový marker ­ 14-160 kDa Elektroforetický pufr (25 mM Tris-Cl, pH 8,3, 150 mM glycin, 0.1%SDS Nanášecí pufr 1. Ke 30 ul vzorku krevního séra přidejte 6 ul nanášecího pufru, promíchejte a inkubujte 5 min při 100°C v termostatu 3. Následně zkumavky zchlaďte na ledu 4. Poté naneste na 3 gely po 10 ul vzorku a 5 ul hmotnostního markeru 5. Spusťte elektroforézu, podmínky separace: konstantní proud 30 mA/gel, 40 minut 6. Po elektroforéze první gel propláchněte 15 minut v MiliQ vodě a následně ponořte do 50 ml barvy koloidní coomasie BioSafe, s druhým a třetím gelem proveďte blotting. 7. Gel ponořený do koloidní coomasie po dvou hodinách vyjměte a propláchněte vodou a naskenujte. Blotting Roztoky: Přenosový pufr (25 mM Tris-Cl, pH 8,3, 150 mM glycin, 20 % metanol, 0.1%SDS) 1. připravte si dvě membrány PVDF a 8 papírů Whatman 3MM o rozměrech 7x5 cm. 2. Ponořte PVDF membrány na 20 s do MeOH (snížení hydrofobicity membrány) a poté je inkubujte 5 min v přenosovém pufru společně s 8 papíry Whatman 3MM 3. Sestavte sandwich dle obrázku níže. 4. Spusťte semi-dry elektro transfer, 8. Provádějte přenos 1 h při konstantním napětí 30V 5. Po skončení blotting vyndejte membrány a ponořte je na 5 min do barvičky Ponceau S. 6. Poté je opláchněte ve vodě a pomocí propisky zaznačte marker. Úloha č.7: Identifikace glykoproteinů krevního séra pomoci SDS-PAGE a Western blot analýzy Pokročilé praktikum z Biochemie (122009) 3 Detekce pomocí Konkavalinu A a Anti-Human IgG protilátek Roztoky: TBST pufr (20 mM Tris-Cl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 0,1 % Tween-20) Con A-HRP konjugát (1mg/ml) Roztok DAB 30% peroxid vodíku Detekce pomocí Konkavalinu A 1. Neobsazená vazebná místa blokujte v 20 ml roztoku 1 x TBST obsahujícím 5% sušené mléko (nízkotučné) po dobu 30 minut 2. Dvakrát membránu promyjte 20 ml 1 x TBST pufru po dobu 5minut 3. Inkubujte membránu ve 20 ml TBST pufru s 50ul Con A-HRP konjugátu po dobu 2 hodin. 4. Dvakrát membránu promyjte 20 ml TBST pufru po dobu 5minut 5. Ponořte membránu do 20 ml TBS s 0.05% DAB a přidejte 20 ul 30% peroxidu vodíku 6. Inkubujte membránu v roztoku, dokud se neobjeví barevné proužky ­ asi 10-15 minut 7. Poté zastavte reakci promytím v Mili-Q vodě 8. Naskenujte membránu Detekce pomocí Anti-Human IgG protilátek 1. Neobsazená vazebná místa blokujte v 20 ml roztoku 1 x TBS obsahujícím 5% sušené mléko (nízkotučné) po dobu 30 minut 2. Inkubujte membránu ve 20 ml protilátky ředěné TBST pufrem v poměru 1:30000 po dobu 2 hodin. 3. Dvakrát membránu promyjte 20 ml TBST pufru po dobu 5minut 5. Ponořte membránu do 20 ml TBS s 0.05% DAB a přidejte 20 ul 30% peroxidu vodíku 6. Inkubujte membránu v roztoku, dokud se neobjeví barevné proužky ­ asi 10-15 minut 7. Poté zastavte reakci promytím v Mili-Q vodě 8. Naskenujte membránu VYHODNOCENÍ 1. Uveďte výsledek elektroforézy a blottingu (výsledný obarvený gel a membránu) 2. Na základě hmotnostního markeru sestrojte kalibrační křivku a odečtěte hmostnosti proteinů detekovaných na membráně. 3. Popište a zdůvodněte barvení jednotlivých proteinu Konkavalinem A a Anti-Human IgG protilátkami.