Fenotypová variabilita izolátov zelenej vláknitej riasy Klebsormidium crenulatum a jej molekulárno-fylogenetické vzťahy v rámci rodu Klebsormidium Univerzita Komenského v Bratislave Prírodovedecká fakulta Katedra botaniky1 & Katedra molekulárnej biológie2 Bohuslav Uher1 & Katarína Šramková1 & Gabriel Minárik2 Ciele: ● zistiť taxonomicko-morfologické rozdiely rias Klebsormidium crenulatum a K. flaccidum ● analyzovať gén 18S rRNA riasy Klebsormidium crenulatum zo zbierky kultúr Katedry botaniky PRIF UK - štandardizovať PCR - zistiť fylogenetické vzťahy ● Pozn. V databáze GenBank zatiaľ chýba akákoľvek sekvencia riasy Klebsormidium crenulatum ! Taxonomické a fylogenetické postavenie rodu Klebsormidium Zelené rastliny (Viridiplantae, syn. Chlorobionta) 2 vývojové línie: - zelené riasy (Chlorophytae) - streptofyty (Streptophytae) Streptophytae: ● ortomitóza ● fragmoplast • Charophytae • Bryophytae • Cormophytae Chlorophytae: ● uzavretá mitóza ● fykoplast ● slepá vývojová línia Taxonomické a fylogenetické postavenie rodu Klebsormidium ● Fylogenetické analýzy na základe sekvencií 18S rRNA potvrdzujú, že Charophyceae a suchozemské rastliny vytvárajú monofyletickú skupinu ● Na základe štúdií fylogenetických vzťahov medzi rôznymi zástupcami všetkých piatich radov Charophyceae, je vetva radu Klebsormidiales umiestňovaná na bázu s ostatnými radmi Charophyceae, ako aj zástupcami Bryophyta Klebsormidium strom Fylogenetické vzťahy medzi 19 taxónmi streptofýt na základe chloroplastovej SSU a LSU rRNA, strom vypracovaný metódou ML (podľa Turmel et al.2002). Ekológia druhov rodu Klebsormidium ● terestrické, sladkovodné, antropogénne zaťažené a urbanizované biotopy ● K. crenulatum agresívny kolonizátor terestrických biotopov priemyselných komplexov Porúria a Porýnia v severozápadnom Nemecku Ekológia skúmaných kmeňov K. crenulatum - hydroterestrické biotopy, prímorská Antarktída - hypogeický biotop, Gombasecká jaskyňa - hypogeický biotop, krypta Chatama Sófera Kmene Klebsormidium crenulatum: 1- 4. Kmene ANT-2004/1-4 z hydro-terestrického biotopu ostrova Kráľa Juraja (subregión prímorská Antarktída) 5. Kmeň GO-2003/5-4, z Gombaseckej jaskyne 6. Kmeň CHS-1998/13, z náhrobku krypty Chatama Sófera Materiál a metodika Laboratórna kultivácia kmeňov ● paralelne pestované v laboratórnych podmienkach: - 20-22°C - svetelnom režime 16:8 - agarom spevnené a tekuté minerálne kultivačné médiu BBM. ● testované na organických médiách (0,1% kvasničný extrakt a 0,1% glukóza), kvôli vylúčeniu potenciálnej kontaminácie Markery druhu Klebsormidium flaccidum – na základe laboratórnych kultivácií Klebsormidium flaccidum Na agarových platniach: -tenké homogénne kolónie, bez vlnitej štruktúry V roztoku: -zelený prstenec na hladine roztoku v skúmavke a hustý chumáč na dne skúmavky Vlákna: -40-50 bunkové, rovné Zoosporogenéza: -prítomnosť biflagelátnych zoospór -póry v bunkovej stene - Markery druhu Klebsormidium crenulatum – na základe laboratórnych kultivácií Klebsormidium crenulatum Na agarových platniach: -stredovo súmerné, zreteľne vlnité kolónie (veľmi dobre rastúce) V roztoku: -ponorené chumáče na dne skúmavky (slabo vyvinuté) Vlákna: -50-85 bunkové, špirálovito zvlnené Aplanosporogenéza Nepravé rozkonárovanie Klebsormidium crenulatum Kl Kl 15 dní, agar BBM P018 20 dní roztok BBM mierka 10µm PCR Použité primery pre amplifikáciu úsekov 18S rRNA: 5‘-3‘ CTGGTTGATC CTGCCAGTAG (Oligo 1) 5‘-3‘ GTGAACCTGC AGAAGGATCA (Oligo 2) Štandardizácia podmienok PCR: 1. PCR premix TrueAllele (ďalej TA) od firmy Applied Biosystems (USA), ● 4 μL H2O, 9 μL TA premixu, po 0.5 μL 10pmol/μL oboch primerov, 1.5 μL DNA, výsledný objem reakcie 15 μL, ● anelačná teplota 50 °C - primery sú dobré, ale PCR ma slabý výťažok Izolácia DNA ● kit na izoláciu celkovej DNA (NucleoSpin,Macherey-Nagel) Čiastkové výsledky PCR 2. Long PCR Core kit od firmy IzogenLab (Rusko), ● 10 μL H2O, po 2.5 μL 1pmol/μL oboch primerov (podľa odporúčaní výrobcu), 5 μL DNA, výsledný objem reakcie 20 μL, ● anelačná teplota 50 °C - PCR na templátoch z rias vôbec nebežala 3. Reakcie s Phusion polymerázou; ● 10.4 μL H2O, 4 μL 5xGC rich pufru pre Phusion polymerázu, 0.4 μL 10mmol/l dNTPs , po 1 μL 10pmol/ μL oboch primerov, 0.2 μL 2U/μL Phusion polymerázy, 3 μL DNA, výsledný objem reakcie 20 μL, 50Ca-G13_2006-Phusion Polymerase-50C 53C-G13_2006-Phusion Polymerase-53C 55C-G15_2006-Phusion Polymerase-GCandHFbuffer-55C opr PCR s Phusion polymerázou 50°C 53°C 55°C Sekvencia zo vzorky č.2 (Klebsormidium crenulatum) 640 bp G+C 50,47% A+T 48,91% Poďakovanie •Grant UK 209/2005 •Grant VEGA 1/2343/05 •Grant UK 222/2006 Ďakujem za pozornosť