FRA NALY1
ÍAKCIONACE BUNĚK / SEPAI YTICKÉ TECHNIKY / PROTEI NÍZKOMOLEKULÁRNÍ LÁT
♦ HOMOGENIZACE TKÁNÍ, BUNĚK, CENTRIFUGACNÍ TECHNIKY
♦ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE, SEPARACE A
ANALYTICKÁ STANOVENÍ, MALDI TOF
♦ PLYNOVÁ CHROMATOGR
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
HOMOGENIZACE TKÁNÍ / BUNĚK
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
CENTRIFUGACE / ULTRACENTRIFUGACE
úhlový rotor výkyvný rotor
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
diferenciální centrifugace
nich frakci
um
nii-koobrAtkovi c«ntri4ugac«
homogunii
V
J -.SUPEANaTaNT 1
STť«MJri6obrí lícová
ccnlrrfugfce
celé buiMcy.
-| SUPE BIVATANT 2
I
SEDIMENT 2
miT0chondrier ■y- " Sdi'iy.
►fa :v.
u llrBcanrtrifugace
I
SEDfMENT 3
dalii malů vAdky
SEDIMENT 4
vijy,
velice makromolekuly
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
(n
CENTRIFUGACE V SACHARÓZOVÉM GRADIENTU
kle' '
ce
; navázaným ligand em
m
Vfor#k CENTRhFuGACť
flf*diflnl
rycht*
■#ddmfitTUJiCí iEů!kí
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Kapalinová chromatografie (LC, HPLC)
MPA I
DÁVKOVÁNÍ
Sampling System
DETEKTOR
Detector
Detector Oven
Detector Electronics
Potentiometrie Recorder or Computer Data Acquisition and Processsing System
T
Column
Column Oven
Oven Controller
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
HP
stacionárníc
mobilních fáz
♦ REVERSNÍ FÁZ
nepolární stacionární fáze (C18, C8, fenyl) vs. mobilní fáze se snižující se polaritou (voda/metanol, voda/acetonitril/THF)
♦ NORMÁLNÍ FÁZE / IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE
polární stacionární fáze (amino-, OH-) vs. mobil fáze se zvyšující se polaritou
♦ GELOVÁ PERMEAČNÍ CHROMATOGRAFIE
♦ AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
specifické zakončení stacionární fáze (protilátka, SH- apod.), rozdělení na základě specifických interakcí
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
aetekto
♦ FOTOMETRICKÝ (změna absorpce, jedna vln. délka nebo diode array detektor       spektrum analytu)
♦ FLUORIMETRICKÝ (změna fluorescence, jed excitační a jedna emisní vln. délka nebo diode array)
RADIOMETRICKÝ (sloučeniny značené 3H, 13C, 32 33P)
♦ HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETR (stanovení m/
♦ další detektor
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Uspořádání spektrofotometrického
zdroj světelného paprsku absorpce světla
iviALUi iur-m^ (matrix Associatea Laser uesorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)
záklaaní uspořáaání
Optics
Sample \ Probe V
Trigger
Ultraviolet
'.Kill*
Data Analysis
Oscilloscope
Detector
Drift   *..
Region (m/z)
Deflection Plates
J Amplifier Vacuum
Voltage Potential
konverze dat:    TOF spektrum ( t = (m/z)1/2
hmotnostní spektrum
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorpti
Time of Flight Mass Spectro
Ionization
metry):
ion
izace v
zorku
Pulsed Laser Beam N, ~337nm
t T*
TOF MS
Ums
Sample
(matrix + anal}
Sample Holilťr
VVzkumnV ústav veterinárního lékařství v Brně
Gelová filtrace (gelová permeační chromatografie)
rom
ÍCk r0jp>OU*trdl*
l   i I
/fldrřuvane wlné prochaieprcp
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
Gelová filtrace: separace standardních bílkovin /
spektrofotometrická detekce
Gelová filtrace s radiometrickou detekcí specifickou pro značený substrát a metabolity
120   140 100
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
loni
t
let rGJpouůiédlj
i
i
* *
• ** v .v.
■ A  * + W
npbltV väl n J
klŕdŕlr>
ni.:nlrfcij]j
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Ionexová HPLC: rozdělení proteinů zvyšující se iontovou silou mobilní fáze
■ VI.
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Afinitní chromatografie
Na sorbentu
navázaný
substrát,
protilátka,
koenzym
apod.
tok loztbůuri+dU
i  i i
I
1 k&v*l#ntnÉ fuiblrilftm
porvou
v4kné {3iQlO-kJ|i
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
♦ Koncentrace steroidního hormonu, stanovení aktivity CYP3A isoenzymů (6beta-OH-T), CYP19 (T - E2)
♦ Koncentrace mastných kyselin, stanovení aktivity PLA, COX, LOX apod.
Stanovení cizorodých látek, které se obtížně zplyňují nebo jsou termolabilní (vysokomolekulární PAHs)
♦ Preparativní HPLC (izolace nukleotidů, metabolitů, peptidů, protilátek atd.)
♦ MALDI-TOF (LC-MS velkých mole fragmentovaných bílkovin)
l -
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
Reversní HPLC analýza PAHs: detekce pomoci diode-array detektoru (DAD)
HPLC analýza hydroxylovaných metabolitů testosteronu (spektrofotometr. det
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce)
Stanovení aromatázové aktivity (HPLC analýza koncentrace produktu - E2)
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
MALDI TOF-MS (Matrix Associated Laser Desorpti Ionization Time of Flight Mass Spectro
lad stanoveni peptidovýc
prii
metry): h fragmentů
on
Xj Vi       *2 Vz zs x, y, z.
I1	0 n			0 II		I5	0 II		1*
h^N-c-	n -C-	■m-1	i -C-1	n ■C-	■n-1	1 C-1	n c-	Ni	;-cooh i
		A	/)						
	b	i ^	as		3	a	3 b.	<*	
Fragmenty po rozštěpení vazeb peptidů
FVMQHLEG3HLVEALVLVHQH?aFFrrPKA
Iontová fragmentace peptidu (ion decay mass spectrum):
- přesné stanovení mol. hmotnosti;
- primární sekvence
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
UŽITI LC PRO FRAKCIONACI VZORKU - PŘIKLAD STANOVENI
GANICKÝCH CIZORO
SAMPLING EXTRACTION
HIGH-MOLECULAR FRACTION
PAH FRACTION
Silica gel fractionation
DCM/ hexane
DCM
ALIPHATIC FRACTION
NEUTRAL AROMATIC FRACTION
Aminopropyl silica column
NPAHs, oxy
PAHs
carboxy-, aldehydes etc.
HPLC, G
PAHs<252 PAHs>252
PLC
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
GPC
Uspořádáni plynového chromatografu (GC)
Detektory:
fid
ECD (chlor. látky) MS (rozděleni podle hmotnosti fragmentů)
Gas Supply Unit
f low Controller
Flow Programmer
I
Sampling Unit
Injector
(Manual or Automatic)
Injector Oven
Microprocessor for Flow Controller and Ftogranuner
Injector and Injector Oven Controller
Column Unit			
	Colnmn		
		Colimm	
		Oven	
Detector Unit
Detector
Deťector Oven
Column Oven Controller and Programmer
Detector Electronics and Computer Data Acquisition and Processing System
Detector Oven Controller
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GC: Přechod látek mezi stacionární a mobilní fází
Mobile Phase
Solute Transferring From the Stationary Phase to the Mobile Phase at the Back of the Peak Profile
Profile of Solute Concentration in the Stationary Phase
Stationary Phase
Direction of Flow
Profile of Solute Concentration in the Mobile Phase
Solute Transferring from the Mobile Phase to the Stationary Phase at the Front of the Peak Profile
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GC/ECD (electron capture detector): princip dete
c
Ni63
anoda
V
— Cl
+ e"
— Cl"
vychytávání elektronů chlorovanými látkami, snížení el. proudu
Ni63
= b-Záfič
nosný plyn + analyty
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
GC/MS:
analýza PAHs (SIM - fragmenty M+ = různé MW)
MW 202
MW 228 MW 252
MW 242
Chromatogram Plots
P lot 1: P lot 2: P lot 3: P lot 4: P lot 5:
\saze_2_25.1 0.2004_2 M l \saze_2_25.1 0.2004_2 M l \saze_2_25.1 0.2004_2 M l \saze_2_25.1 0.2004_2 M l \saze_2_25.1 0.2004_2 M l
l z 300_ric.sm s RIC all l z 300_202.sm s Ion: 20 2 all l z 300_228.sm s Ion: 22 8 all l z 300_252.sm s Ion: 25 2 all l z 300_242.sm s Ion: 24 2 all
M Count:
7654 3210-
M Count
kC ounts
500 400 300 200 100 0
125 100 75 50 25 0
kCounts 30
RIC all saze_2_25.10.2004_2 Ml z 300_ric.sms
I §3 I
Ion: 202 all saze_2_2 5.10.200 4_2 Ml z 3 0)_2 02.s
Ion: 228 all saze_2_2 5.10.200 4_2 Ml z 30)_228.s
I §£ s ŕ-
Jul
Ion: 252 all saze_2_2 5.10.200 4_2 Ml z 3 0=)_2 52.s
Ion: 242 all saze_2_2 5.10.200 4_2 Ml z 3Cf)_2 4 2.s
12.5
17.5
20.01
kCounts
20
10
7.5
10.0
15.0
2 2'5
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENI ENZYMATICKÉ AKTIVIT
OVÁ KINETIK
NZYM
Y /
♦ Stanovení produktu:
koncentrace produktu / čas . prot. = pmol produktu / min. (mg prot./ml)
♦ Příklady stanovení:
- fluorimetrické stanovení produkce resorufinu (EROD, MROD, PROD, BROD);
- HPLC stanovení metabolitu mastných kyselin, např. 5-OH-FA (5-LOX);
- chemiluminiscenční stanovení luciferázy
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
inzymová kinetika: [ES] = (E + ES) . [S] / KM + [S] (počáteční rychlost: v0 = V . [S] / (K + [S])
Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
SUBSTRA
ATY ENZYMOVYC
CH REAK
Cl
spektrofluorimetrická detekce produktu enzymové reakce -silně flureskujícího resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm)
VVzkumnV ústav veterinárního lékařství v Brně
Enzymová kinetika: dvojitě reciproké vynesení (Lineweaver- Burke: 1/v0 = (KM/V)(1/[S]) + 1/V