JE / ♦ SPEKTROFOTOMETRE / TURBIDIMETR FLUORIMETRIE / LUMINOMETRIE ♦ STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT - stanovení hladin enzymů; - sledování genové exprese (reportérovy gen); - aktivace enzymů (např. PLC v signální transdukci - vizualizace proteinů a NA na gelech ♦ IMUNOHISTOCHEMICKÉ BARVENÍ - proteiny, nukleové kyseliny; - barvení organel; morfologie buněk ♦ DALŠÍ INTRACELULÁRNÍ EFEKTY - stanovení koncentrace Ca2+, thiolových skupin (GSH, proteiny); membránový potenciál, pH; - cytotoxicita / viabilita / proliferace / apoptóza Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně ♦ Absorpční spektrum: spektrum vnějšího záření je ochuzeno o frekvence (vln. délky), které odpovídají rozdílům energií buzených atomů (např. žlutá barva látky odpovídá absorpčnímu pásu 435-480 nm, červená 490-500 nm, modrá 580-595 nm) ♦ Energii molekuly lze vyjádřit součtem energie elektronové, energie vibrační a energie rotační (E = Eel + Evib + Erot): - UV + VIS (absorpce - excitace valenčních elektronů), event. absorpce a emise (luminiscence); - IR absorpce - excitace rotač. a vibr. stavů molekuly IR absorpční spektrum); - mikrovlny - excitace rotač. stavů molekuly (mikrovlnná abs. spektra) a excitace nepárových elektronů v magn. poli (paramagnetická resonanční spektra) - radiovlny - excitace atomových jader (NMR spektra) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně KCE - enzymové aktivity (fluorogenní substráty - histochemická detekc - koncentrace látek (Ca2+, DNA, NH2-, SH-) -pH - membránový potenci* - fluidita membrán -derivatizace analytů pro detekci v HPLC 514 ses 647 ABSORPTION FLUOHE5CEMCE 30O 400 700 R-Phycoerythnn (pH 7} Alexa Fluor 647 (pH 7) Alexa Fluor 680 (pH 7) DilC,,(3) (MeOH) Rhodamine Red-X (MeOH) Alexa Fluor 660 (pM 7) Alexa Fluor 546 (pH 7) Texas Red (pH 7) YOYO-1 + DNA -H Loqiferin COOH CQOH h IflQOOO Et— r\' t- (JĹJ fJĽ< 'X' ťJ. m ^ ^ [j^ ^ ^ 1?g jj- £j] j |j] 1ÍDO00 Rl.U /MOĽ- Lucŕferin-ME ■... 'n-,- COOK COOH cl'-r>JT-(ůqpcgoi(í?C^-ÍD'-' c — *- cy«PJ t-rt-KJmt-lt [i- (4 i- n , < ~3 >- u. *i ^ 1500000 5CĽCU0 i LucHarln-ME EGE Luciíerďn 100000 Luciferi n-CEE COOH LuciÍB'in L< < tíl íl u- 1300000-, LucffadO-BE LiKŕíerin SDDQOO^COOH CQOH 5 00000 -r ' N RLU 30ocao- ttOQQfr 50Ů00O LucHerin-H EGE Lucifera Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně 5 Hli REAKCI CYP3A4 (detekce: spektrofotometrické stanovení HCHO) (CH3)2N Aminopyrine P450 +ÍHCHO Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně Glutathion-S-transferázy (GST); spektrofotometrická detekce; různá substrátová specifita jednotlivých isoenzymů; neselektivní substrát CDNB: GSH GST l-Chloro-2,4*dinÍtrobenzene (CDNB) HC1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně Í ENZYMOVÉ AKTIVI PROTEIN Ů TÉROVÝC ♦ Chloramfenikolacetyltransferáza (CAT -separace 14C-chloramfenikolacetátu pomocí TLC; - substrát značený BODIPY ♦ (3-Galaktosidáza ((3-D-Gal) pomocí značeného fluorogenního substrátu: - 4-methylumbelliferyl-p-D-Gal (360/449 nm, modrý produkt); - fluorescein-p-D-Gal (490/514 nm, zelený produkt); - resorufin-p-D-Gal (571/585 nm, červený produkt) ♦ Luciferáza: CL (luciferin + ATP) ♦ Green Fluorescent Protein (GFP) - autofluorescence, pro stanovei hladiny exprese není třeba vnější substrát ♦ Alkalická fosfatáza (p-nitrofenylfosfát, 4-methylumbelliferylfosfát) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně CH REAKCI STANOVENI EXPRESE (AKTIVITY) REPORTÉROVÉHO GENU LUCIFERÁZY \ /\cooh luciťerase yylv //-\ + atp + 0s-> />-\ + atp + pp,+ c02 + Luciferin Oxyluciferin Light Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně kKTIVITA REPORTÉROVÉHO GENU - LUCIFERÁZY INDIKUJ KTIVAC .r : AhR vá exprese TCDD and Related uciferin + ATP xyluciferin + ADP + hv □ + JAhR ChSP9C (g) Nuclear Factors DRE-Luc 'Activated" \ Increased Protein Modulation of Gene Phosphorylation Expression Membrane Proteins Cytosolic Proteins Adapted from Blankenship (1994) Luciferase Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně MŮŽEME STANOVIT GENOVÉ EXPRES INDUKCI E ? ♦ Příklad - stanovení transaktivace AhR: - exprese reportérového genu, chemiluminisceční stanovení luciferázové aktivity (DR-CALUX) - stanovení exprese CYP1A1 mRNA (RT-PCR) -stanovení hladiny proteinu CYP1A1 (Western blot) - stanovení enzymové aktivity CYP1A1 (EROD) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVENÍ AKTIVITY ENZYMŮ A Z-DEVD-N ^^s^S M ^ COOH Caspase-3/7 DEVD- + fsL ^COOH + ATP + O, Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVENI AKTIVITY ENZYMU APOPTO ZY H Z-LETD-N ^^^N^ Caspase-8 oř 9 | Z-LETD N * + ATP + O, Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně PRODUKCE ROS C-OCH O ii CH -C-0 Dihydrorhodamine 123 difunduje přes buněčné membrány a je oxidován na fluorrescenční Rhodamine 123 (citli dá m na H2O t a HOCI 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (dichrorofluorescindiacetát) je po vstupu do buňky podroben esterázové reakci; detekuje ROS včetně NO (H2O2, superoxi eroxyl HOO Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně PRODUKCE RO S H2O2, superoxid, HO, HOCl, NO, HOO. (N03~)2 Dimethylbisacridiníum Nitráte (Lucigenin) H2O2, superoxid Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVENI KONCENTRACE PROTEINU - spektrofotometricky (absorbance 280 nm); - různá činidla selektivní na aminokyselinové zbytky, nejužívanější je stanovení pomocí kyseliny bicinchoninové (bicinchoninic acid, BCA): Primární substrát: CuS04 .5 H2O; Cu(II) je proteiny redukován na Cu(I) a ten je detekován pomocí BCA; fotometrické stanovení, i v 96-jamkových destičkách; kalibrace na BSA; nízká citlivost metody na přítomnost detergentů ii Existuje řada fluorogenních sond, klasickým příkladem je Fura-2: 120 | 100 □ E Lj.l 40 | 20 300 EiCitatíon Wavelength (nm) fura-2/awi o 320 340 3«0 330 400 Calcium-sensitivní chemická sonda (zvyšující se koncentrace Ca2+ zvyšuje fluorescenci při excitaci 340 nm; detekce 510 nm) Fura-2/AM (acetoxymethylester) má nízkou fluorescenci; po vstupu do buňky je hydrolyzován esterázami na Fura-2) Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně H STANOVENI MEMBRÁNOVÉHO POTENCIÁLU cl hr QiH5 h ''h o 480 500 520 540 560 5&0 600 620 Wůval&ngil"! (nm} závislost na pH červený agregát JC-1 VVzkumnV ústav veterinárního lékařství v Brně ECL Plus Western Blotting Det Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně I METOD Fotometrická detekce lipidní peroxidace pomocí kyseliny thiobarbiturové (detekuje hydroperoxidy lipidů) Stanovení aktivity NADPH oxidáz a „konzumace" NADPH v buňkách (snížení absorpce při 340 nm) Stanovení cytotoxicity, viability, proliferace buněk - MTT (methylthiazoltetrazoliumbromid) se v mitochondriích přeměňuje na barevný nerozpustný formazan (pro kvantitativní stanovení je rozpustěn po inkubaci buněk s SDS) - XTT produkuje rozpustnou formu formazanu (opět fotometrická detekce - Neutrální červeň - příjem do buněk - Kombinace calcein AM (fluorogenní esterázový substrát -zelený produkt) + ethidium homodimer-1 (ten vstupuje jen do mrtvých buněk a barví NA červeně) ♦ Další informace např. v užitečném katalogu firmy Mole ww.probes.com) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně