, .z IDY: FUNKCE, IZOLACE. SEPARACE, DETEKCE ♦ FOSFOLIPIDY chemické složení a funkce v buněčných membránách; metody stanovení fosfolipidů fosfolipázy - produkty reakcí (ceramid. DAG = 2nd messengers) a stanovení enzymových aktivit lipá ♦ MASTNÉ KYSELINY chemické struktury mastných k mastné kyseliny - 2nd messengers a prekursory dalších lipidních signálních molekul stanovení aktivity LOX. COX. CYP ♦ POUŽITÍ INHIBITORŮ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE PLA2. PI-PLC. PC-PLC. DAG-lipáza; inhibitory LOX. COX. CYP z Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně GLYCEROLFOSFOLIPID Y / FO ZY PLD O OLOrP-O-R O PL& R3 cholin etanolamin serin inositol Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně GLYCEROLFOSFOLIPIDY Fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C a fosfolipáza D (reakce fosfatidylcholin-specifické fosfolipázy C není znázorněna) Ptdlns Ptd cholin choline slow PtdlnsP, PL-C \ fast DAG InsP. e Ca 2+ r KC /1\ /1\ PL-D Ptd arachídonic acid i prostaglandins and others Co stanovujeme: - složení fosfolipidů; - hladiny DAG, ceramidu. - produkci mastných kys. a metabolitů mastných kys. (AA, prostaglandinů leukotrienů aj.) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně SFOLIPIDY SFINGOFO Funkce DAG: (aktivace PKC, proliferační signály aj.) o Různé funkce ceramidu v různých typech buněk (aktivace PK, fosfatáz, apoptotické signály SphJii&omyrlin Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVENI FOSFOLIPIDU HPTLC: Fosfolipidy odvozené od glycerolu - skupinová analýza; Sfingomyeliny - skupinová analýza; Izolace skupiny pro další analýzu (LC/MS) LC/MS: Stanovení jednotlivých fosfolipidů - analýza celého vzorku (lyzátu buněk, liposomů apod.); - izolace HPTLC - analýza LC/MS; - separace skupin na kolonce SPE - analýza LC/MS Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně „PHOSPHOLIPIDOMICS" (HPTLC) NOVENI FOSFOLIPIDU P-PE d-PE PS 5 M 7 20 30 Time (min) 40 Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně SO NOVENÍ FOSFOLIPIDU Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVENI CERAMIDU A DAG METODOU Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně FLUOROGENNI ANALOGA LIPIDU CHg[CH2)1 2CH = CHCHOH H„C p p (CHJ,-C-hJHCH O V J 2 4 ir 1 n + <^^^^J^^ CH2C^-P-OCH2CH2N(CH3)3 Příklad užití: - stanovení enzymových aktivit SMázy, SMsyntáz BODIPY FL Cs-sphingomyelin. CH3(CH2)12CH = CHCHOH HSCL F ,F (CH^K-C-NHCH ^-N' "A O CH2OH BODIPY FL C5-ceramide. CH3ÍCH2)12CH =CHCHOH NH(CH2)5-C -NHCH ^L^N ° CH2OH N02 NBD C6-ceramide. Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně UORIMETRICKE S Quenched substrate (bis~BQDIPY FLCn-PC) 210 1l* I II + OT CH20-P-OCH2CH2Nl.CH.J)3 — Pnosphohpase A, Quenched substrate (PE06) o LI a4 11* I H -o NOU Phosphoíipase A„ o l! o2n I Q H3C F F (CHarl5-C-OCHa HOCH O CH-O-P-OCILChJhCH^ Fluorescent lysophospho lipid ó Nonfluorescent íysophospholjpid CH3(CM?|i:rC-OCH? HOCH O O V—> CH20-P-OCH2CH2Hri--í-[CHaJsMH—ř V- Fluorescent fatty acid {BODIPY FL C1n (D-3362)) Fluorescent fatty acid (BODIPY FL C5 (D-3934)) Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně STANOVE NÍ AK TIVITY PI-PLC POMOCI WESTERN BLOTU ♦ Stimulace buněk, lyze ♦ Imunoprecipitace (protilátka proti PI-PLC + protein A - Sepharose) ♦ PAGE a transfer proteinů na membránu ♦ Protilátka proti PI-PLC nebo proti fosforylované tyrosinu (detekce aktivované formy enzymu) Vizualizace proteinu (ECL n Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně MASTNÝCH KYSELIN fosfolipasa A2 lysofosfolipid rachidnnová kyselina fosfatidylinositol fosfolipasa C fosfoinositol 1,2-diacylglycerol- diacylglycerolj diaeylglyccrollipasa kinasa I fosfatidová monoacylglyccrfil kyselina + fosfolipasa AJ uraehidonová kyselil lysofosfatidová kyselinu + uraehidonová kyselina Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně MASTNE KYS ELINY NASYCENÉ MASTNE KYSELINY: - máselná (4:0) - laurová (12:0) - myristová (14:0) - palmitová (16:0) - stearová (16:0) METODA STANOVENI: HPLC, fluorimetrická derivatizac HPLC / radiometrická nebo refraktometrická detekce GC po derivatizaci (methylaci) e NENASYCENE MASTNE KYSELINY olejová (18:1) linolová (18:2, příklad n-6 kyseliny) linolenová (18:3) arachidonová (20:4) eikosapentaenová (20:5) dokosahexaenová (22:6) HPLC / fluorimetrická detekce nebo HRGC/MS ce Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci pyrenyldiazomethanem Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor. detekce) METABOLISMUS MASTNÝCH K 6 í W-COOH /X/X/20 \-^ ■ 1t 12 Arachidonlc actd Lipoxygenasesy< Cyclooxygenase P450S ■ LT EETs PGs HPETEs HETEs TxA2 HETEs to alcohols PGI2 Lipoxins o>1 alcohols Hepoxllins Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně MASTNE KYSELINY (CYP ENZYMY ZODPOVEDNE ZA OXYGENÁZOVÝ METABOLISMUS) Detekce a kvantifikace metabolitů pomocí HPL nebo GC/MS 14,1 5-EET 5,6^DíHETE * ( ltl Z-DWETE i cc í 4.15-OWETE 20-OH AA I9-OH AA VVzkumnV ústav veterinárního lékařství v Brně CHIDONOV RSOR conn ■g ty kl ooxy genaso vá aktivita (irthíbiůt aspirinem) COOH G 00II 00 H PGG, 2GSH GS5G aktivita ■ COOJ [ 204 cylflizufícj dráha iij-uthidonová kyselinu LOX COX p jvľťluj" Lun d i liiearilíijící ÜOfI 5 ■ h j J rope rnjy. ikOKiittlmcn ■ kyselinu HOO. I Z-liydropuľu ji\-ikij^íitťľľiiťn-k>stlihji nebi) HOC). 1 yd ropu nn y ■ j kuKiitulniťn -kyselinu Stanovení aktivit COX a LOX: GC/MS nebo HPLC metabolitů AA , ĽOOH -COfJH /jouh cooh leukútriťnv VVzkumnV ústav veterinárního lékařství v Brně STRATEGIE DETEKCE KLÍC DRAH MECHANISMU TOXIC OVYCH SIGNALNÍC O H ITY XENOBIOTIK EXPOZICE TESTOVANYMI LATKAMI SPECIFICKÉ INHIBITORY AKTIVACE ENZYMU Specifické inhibitory CYP, COX, LOX, PLA2, PI-PLC, PC-PLC, a MAPK; antioxidanty MODULACE SIGNALNÍ TRANSDUKCE A GEN. EXPRESE MODULACE BUN. CYKLU, PROLIFERACE, MEZIBUNĚCNYCH SPOJENÍ Výzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně