Identifikace a klasifikace mikroorganismů založená na shlukové analýze MALDI-MS protein/peptidových profilů 3653 • •jednoduchá, rychlá, spolehlivá • chemotaxonomická technika • vysoká citlivost a reprodukovatelnost • • • • MALDI-TOF MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - - Time of Flight Mass Spectrometry biomolekul a unikátních biomarkerů (peptidy a proteiny) měření m/z molekul nabité ionty v plynné fázi bakteriální buňky organické rozpouštědlo silná organická kyselina + + uvolnění Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem Proč proteiny ????? Proč proteiny?? •Vysoce informativní markery současného stavu kultury •„protein turnover“ – změny za různých podmínek prostředí, stresů.. (technologie, transport kultur, vliv látek…) •Systematické mapování proteinů – taxonomie, studium fce proteinů •Databáze proteomu (SWISSPROT) Analýza MALDI-TOF MS •Jednotný spolehlivý protokol přípravy MALDI‑MS profilů u daného bakteriálního rodu • - OPTIMALIZACE • - podmínky kultivace • - příprava vzorku • - MALDI-MS analýza „intaktních“ buněk • • • - odlišení rodů, jednotlivých druhů rodu • - až individuálních kmenů daného druhu •Vhodný software shlukové analýzy MALDI-MS profilů a následné klasifikace a identifikace bakterií Databáze MALDI-MS profilů Příklad: klasifikace Aeromonas •Aeromonas •Aeromonas hydrophila •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 7232 T •Aeromonas hydrophila ssp. hydrophila CCM 1271 • CCM 1275 • • •Aeromonas caviae (A. media, A. eucrenophila, A. encheleia) • Aeromonas hydrophila (A. bestiarum, A. salmonicida, A. popoffii ) • Aeromonas sobria (A. veronii, A. jandaei, A. schubertii ) • • rod druh poddruh 23 species ,, 17 hybridizačních sk. (genospecies) poddruhy biovary kmen KOMPLEX KOMPLEX Problematická identifikace druhů: aeromonády, laktobacily… Př: aeromonády: úzce příbuzné - 97,9‑100 % shoda sekvencí 16S rDNA - lišící se pouze v rozmezí 0 ‑ 33 bp • nepřesná identifikace biochemickými testy – výsledky vysoce shodné pro většinu druhů • Identifikace: komplikovaná vzhledem k vysokému % shody sekvencí 16S rDNA a fenotypu fylogenetické studie: geny gyrB, rpoD, 16S rDNA, dnaJ platí i pro řadu druhů rodů Bacillus, Lactobacillus, Campylobacter…… 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5683 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 6210 Campylobacter fetus subsp fetus CCM 5682 Campylobacter coli CCM 6211 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6189 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 6191 Campylobacter jejuni CCM 6214 Campylobacter jejuni ssp jejuni CCM 7212 Corynebacterium pilosum CCM 6140 Corynebacterium urealyticum CCM 3975 Corynebacterium urealyticum CCM 3976 Corynebacterium urealyticum CCM 4186 Finegoldia magna CCM 3785 Streptococcus mitis CCM 7411 Serratia rubidaea CCM 3412 Peptostreptococcus anaerobius CCM 3790 Staphylococcus epidermidis CCM 2124 Staphylococcus epidermidis CCM 2446 Staphylococcus epidermidis CCM 7221 Staphylococcus saprophyticus CCM 3317 Score Oriented Dendrogram for bruker_ukazky Distance Level Základy metodiky přípravy a analýzy vzorku: 3. MALDI MS analýza Kultivace na vhodném mediu Možné promytí buněk od media Suspenze buňky : rozpouštědlo Kokrystalizace s matricí Reflex IV (Bruker), kalibrace: lysozym 4. Úprava a zpracování spekter 5. Testy reprodukovatelnosti 6. Shluková analýza spekter 2. Optimalizace přípravy a analýzy vzorku 1. Kultivace: kmeny pro databázi = typové kmeny (CCM, DSMZ, referenční) Následně neznámé izoláty Vlivy během kultivace? Růstové fáze? Buněčné obaly? Bakteriální kmen: sbírkový kmen nebo divoký izolát; klinický izolát Příprava vzorku pro analýzu Pelet buněk+ MALDI matrix zaschnutí RT (možno uchovat na desce) Petriho miska Kultivace dle katalogu kultur overnight Bakteriální kolonie Promytá cca v 1 ml sterilní demineralizované vody Zkumavka Eppendorf Centrifugace 5,5 tis. ot/min pelet + 300 μl sterilní demineralizované vody + 900 μl 96% ethanolu Pelet – v eppendorfce v lednici vydrží měsíce Centrifugace 14 tis. ot/min Bakteriální kmen Příprava vzorku pro analýzu jiný příklad: extrakce v acetonitrilu Buňky z druhé pasáže Suspenze buněk + MALDI matrix sDHB 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (20% acetonitril a 1% TFA) Kultivace Trypton soya agar 30°C 24h 24h buňky + voda : acetonitril 1:1 (v/v) Př: Pseudomonas •Každý kmen • - 3 spoty na MALDI desce • - vysušení při RT • •MALDI-TOF MS analýza • • MALDI-TOF MS analýza mikromakro MALDI destička N2 laser, 337 nm vzorek + matrix napětí 25 kV urychlené, protonované ionty lehčí = rychlejší ZDROJ DETEKTOR ANALYZÁTOR TOF ionizace 13 /24 384 možných vzorků •Hluboké vakuum •Citlivost 10 -15 mol 7232 MALDI-MS profil •Proteiny – ribozomu, membrány • • • • • možnost rozlišit • úzce příbuzné druhy, • neodlišitelné genotypizačními metodami a biotypizací • MALDI‑MS protein/peptidový profil je charakteristickým otiskem analyzovaného bakteriálního kmene 50% sušiny 200 ‑ 6 000 typů molekul = characteristické markery s vysokou rozlišovací silou dostupné analýzou „intaktních“ bakteriálních buněk A. hydrophila ssp. hydrophila 7232T MALDI-MS profil •Podmínky kultivace mají na výsledná spektra malý vliv – určitá hladina konstantních signálů • Vychází se z analýzy „bazální“ výbavy proteomu • konstantní výskyt základních char. signálů • (základní hladina proteinů syntetizovaná stále • nezávisle na změně podmínek) •Pomalu rostoucí – prodloužení doby kultivace •Chemikálie – ! nejvyšší čistoty ! (pro MS či HPLC) •Pozor na uvolňování látek z „nekvalitních“ plastů • • Porovnání spekter 3 typových kmenů různých rodů m/z 0 500 1000 1500 2000 a.i. A. hydrophila ssp.hydrophila CCM 7146T • Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 T Stenotrophomonas CCM 284T 16 /24 Lze hodnotit optickým porovnáním spekter • 4491 4368 4363 4356 4354 2807 1909 1769 667 658 655 srovnání 6000 8000 10000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 a.i. 4491 4368 4363 4356 4354 2807 1909 1769 667 658 655 Porovnání spekter druhů rodu Aeromonas A. caviae “A. trota” A.allo- saccharophila A. schuberttii A. eucrenophila A. sobria A.encheleia A.encheleia A.popoffii A.popoffii A.popoffii • L.casei ssp. casei L. brevis 17 Porovnání spekter kmenů druhu P.aeruginosa (šipka označuje stejné signály odlišné intenzity) • 6000 8000 10000 12000 14000 m/z 0 200 400 600 800 1000 a.i. CCM 1959 CCM 1961 CCM 1960T Možné rozdíly mezi kmeny ??? Nelze hodnotit optickým porovnáním spekter 3653 •1 spektrum - suma 100‑150 zásahů laseru •1 spot 5 spekter •SOFTWARE SHLUKOVÉ ANALÝZY • 1) FI MU - Ing. Matej Lexa, Ph.D. • - spektra převedena na ASCII formát • (mass range 3 000 ‑ 15 000 m/z) • - transformována do páru vektorů • - je vypočítána jejich cosinová vzdálenost a provedeno hierarchické agglomerativní shlukování založené na vzájemné podobnosti spekter • 2) Biotyper Software (Bruker Daltonics) - komerční Analýza spekter m/z signály A. media CCM 3653T 14 /24 , • Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T 13 Rozlišení rodů druhů poddruhů !!! Kmenů !!!! – využití – sledování změn klasifikace jednotlivých kmenů po práci s buňkou Lactobacillus acidophilus group 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus casei ssp casei 4791 Lactobacillus casei ssp casei 4798 Lactobacillus paracasei ssp paracasei P1630 Lactobacillus paracasei ssp paracasei 792T Lactobacillus casei ssp casei 7088T Lactobacillus paracasei ssp paracasei 1837 Lactobacillus amylophilus 7001 Lactobacillus pontis 4540T Lactobacillus salivarius 7274 Lactobacillus sakei ssp carnosus 776T Lactobacillus sakei subsp sakei 7203T Lactobacillus coryniformis subsp torquens 646T Lactobacillus fermentum 7192T Lactobacillus reuteri 777T Lactobacillus acidophilus 4833T Lactobacillus kitasatonis 630T Lactobacillus helveticus 3806 Lactobacillus kefiranofaciens ssp kefirangum 245T Lactobacillus kefiranofaciens ssp kefiranofaciens 244T Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus 7190T Lactobacillus delbrueckii ssp indicus 845T Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 847T Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii 7191T Lactobacillus jensenii 243T Lactobacillus animalis 663T Distance Level Main L. acidophilus groups… Lactobacillus reuteri group Lactobacillus casei group 23 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus delbrueckii ssp indicus 845T Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 847T Lactobacillus brevis 1815 Lactobacillus brevis 3805T Lactobacillus parabrevis 778T Lactobacillus fermentum 7192T Lactobacillus casei ssp casei 7088T Lactobacillus paracasei ssp paracasei 792T Lactobacillus paracasei ssp paracasei P1630 Distance Level 31 Jeden rod – rozlišení druhů a kmenů • 19 Jediný kmen Bifidobacterium catenulatum 4989T analyzovaný Po časové periodě – řadí se stále stejně = důkaz citlivosti metody pro Typizaci až jednotlivých kmenů daného druhu MALDI-MS fingerprints‘ use in species discrimination ·Which bacterial species are present in different parts of technology process? •Reuteri group: • - at least 6 species isolated from sourdough • (L. frumenti, L. pontis, L. panis, L. reuteri, • L. rossiae, L. siliginis, L. secaliphilus) • = species adapted to the particular niche interesting challenge for a proteomic study •to link ecological specification •to functional characteristics embedded in the proteome of the strains. 20 MALDI-MS profiles of pure culturable cultures through technology proces • Analysis without cultivation? Limits: mixtures of strains •Species and strains identity confirmation • control of microorganisms‘ contamination With the other methods‘ undistinguishable mutants or related species 21 The use of MALDI-MS fingerprints in comparing of strains with specific patterns = characterization of the strain •Strain-dependent properties: • probiotics: up (host mucin production) and down regulation (virulence factor expression in pathogens), production of specific antibiotics and antibiotic-like substances (reuterin…) • technology: proteolytic and lipolytic patterns: flavour, ripening, gaps forming … • • • •By novel or uncharacterized strain: • prediction of strain-specific properties outputs of comparable fingerprints of strains, that are unidentified genotypically/phenotypically 24 Optimalizace metody •Test typu a okyselení matrice •(sDHB v 20% ACN s 1% TFA) •Medium, hustota suspenze vzorku • (2 µl buněk + 500 µl voda : ACN 1:1) •Test reprodukovatelnosti •Vliv délky zamražení, kultiv. teplota • • • • BD14866_ BD14866_ BD14866_ BD14866_ 5000 7000 9000 11000 13000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 a.i. sDHB FA SA CHCA Test reprodukovatelnosti, prodloužené kultivace 0 200 400 600 800 1000 Test vlivu matrice A.encheleia prodloužená kultivace (8 dní) A.encheleia standardní kultivace P. putida CCM 7156T Test vlivu medií: CBAH, CBAS, MPA, TSA Ukázky optimalizace pro rod Pseudomonas 5350 5888 8411 4203 2671 7587 3787 4695 9393 3222 6791 Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h I 0 2 4 x10 5349 2671 5888 3851 4205 3222 8414 7577 4695 6792 Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h II 0 1 4 x10 5349 4204 5888 3221 2671 3851 8414 4696 7578 9394 6792 7206 Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h III 0.0 0.5 4 x10 5349 5888 7587 3851 4446 8412 2671 9394 6790 Lactobacillus casei subsp casei 7088T cys I 0 1 2 4 x10 5350 5888 8411 2671 7588 4204 3786 4695 9393 6791 3392 Lactobacillus casei subsp casei 7088T cys II 0.0 0.5 1.0 4 x10 5350 3223 2672 4208 5889 3853 4696 8412 3403 7590 9392 6951 Lactobacillus casei subsp casei 7088T cys III 0.0 0.5 1.0 4 x10 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T Influence of cultivating medium MRS MRS MRS MRS+cys MRS+cys MRS+cys 10 • 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h I MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T I MRS+cys Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h II MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T 20h III MRS Lactobacillus casei subsp casei 7088T II MRS+cys Lactobacillus casei subsp casei 7088T III MRS+cys Distance Level MRS MRS+cys Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T Influence of cultivating medium 11 Small variations in spectra do not influence the certain sume of protein/peptide markers that remain constant (Valentine et al. 2005). , • Lactobacillus casei ssp. casei CCM 7088T MRS and MRS+cys 20h and 46h cultivation 13 In a total dendrogram different samples of the same strain cultivated different period of time in different media form common branche •Citlivá analytická ionizační technika MS (UV laser) •Proteomika: šetrná ionizace peptidů a proteinů •Využití MALDI-TOF MS v mikrobiologii: • MALDI-MS profil - identifikace rodu a druhů • - autentizace kmene • - analýza biomarkerů • Klinická diagnostika: Bacillus (i spory), Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Haemophilus (screening nemocničních kmenů), Helicobacter, Legionella, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus (MRSA a MSSA) • Rychlá chemotaxonomie – i druhy fenotypicky a genotypicky nerozlišitelné • Enviromentální studie, potravinářství – kontrola čistoty, pg MO • Analýza specifických proteinů bakterií, hub a virů: rekombinantní proteiny, faktory virulence, enzymy, metabolity, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, významné je studium bakteriocinů, peptidové mapování • Sekvenování bakteriálních nukleových kyselin •Referenční spektra: je možno identifikovat neznámý vzorek • • BD14866_ BD14866_ BD14866_ BD14866_ BD14866_ 7232 MALDI-MS profil A. hydrophila Využití techniky MALDI-TOF MS • 34 • 26 Lactobacillus CCDM strains were all clustered together to the sub-branche with Lactobacillus salivarius CCM 7274 • very similar spectra of CCDM strains to each other • • 21 Bifidobacterium CCDM strains were all clustered together to the sub-branche with Bifidobacterium thermoacidophillum ssp. thermoacidophillum CCDM 609T 36 Lactobacillus 52 6-57-5A Green signals – identical to reference signals Yellow signals – identical to reference signals with abberation m/z Red signals – distant signals 35 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Serratia liquefaciens 2715 B Serratia liquefaciens 2715 Serratia liquefaciens 2716 Serratia grimesii 2718 Serratia grimesii 4735T Escherichia coli 5172T A Klebsiella pneumoniae 4415 Klebsiella raoultella 3721 Klebsiella raoultella 3722 Aeromonas popoffii 4708T Aeromonas popoffii 4961 Salmonella enterica ssp enterica 4419 Bacillus cereus 1992 Bacillus cereus 2010T Streptococcus mutans 7409T Corynabacterium pilosum 6140T Bacillus subtilis 2216T Bacillus subtilis 2217 Klebsiella pneumoniae 4985 Staphylococcus sciuri ssp rodentium 4657T staphylococcus sciuri ssp. sciuri 3473T Staphylococcus sciuri ssp sciuri 7040 Staphylococcus scuiri ssp carnaticus 4835T Streptococcus salivarius 4046T Distance Level Současné cíle a využití techniky •Zavedení a optimalizace stanovení MALDI-MS profilů bakterií •Ověření diferenciační schopnosti MALDI-MS •Snaha získat : • reprodukovatelná charakteristická spektra rodů a druhů àautentizace, identifikace kmenů •Interpretace a statistické zpracování výsledných • spekter - vhodný software • • 3653 A. media 3653T signál = hodnota m/z Charakteristické spektrum = MALDI MS profil kmene A. media 3653T Výsledný dendrogram Pro shodnocení hladiny spolehlivosti odlišení: identifikace (species) + typizace (kmeny) porovnání různých typů software: Databáze: jen typové a referenční kmeny FI MU Vývoj software Shlukové analýzy Biotyper Software (BRUKER, Daltonics) •Klasifikace neznámých vzorků •Porovnání se studiemi genotypizace •Analýza spekter •Studie hladiny signal-to-noise •Komerčně pro identifikaci . Typizace ?? 22 /24 Současné cíle a využití techniky MALDI-TOF MS Moderní technika pro mikrobiologii •Kapacita v odlišení a klasifikaci kmenů na druhové a poddruhové úrovni (př:MRSA, MSSA!!!) •Přímá identifikace mikroorganismů •rychlý screening či selektivní monitoring patogenů či metabolických produktů MO •Detekce a analýza unikátních proteinů a biomarkerů •Sledování dané kultury v čase!!! 9 /24 Výhody MALDI-MS •Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku •Malý objem vzorku; šetření chemikáliemi •Vysoká citlivost a nízký detekční limit •Vysoce reprodukovatelný výstup • - taxonomie, klin. diagnostika, charakterizace průmysl. kmenů •Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází • a statistického hodnocení výsledků •Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů •Možnost kombinace s dalšími metodami • (off-line separace – ELFO, HPLC) • Výhody MALDI-MS •Vysoce reprodukovatelný výstup bez předchozí separace, filtrování či ošetření buněk •Vysoká rozlišovací schopnost •screening založený na rozšiřující se databázi referenčních spekter mikroorganismů •Děkuji •za pozornost