MALDI-MS analýza mikroorganizmů


http://www.sci.muni.cz/FGP/


                                     Centrální laboratoř (CL)


Centrální laboratoř Masarykovy univerzity (CL) podporuje výzkum na kampusu i mimo něj.
Intelektuální a technická infrastruktura je nezbytná pro řešení komplexních genomických a
proteomických výzkumných projektů. CL umožňuje akademické komunitě přístup k pokročilým
technologiím na bázi sdílené instrumentace a její vysoce kvalifikované obsluhy. Genomické
technologie zahrnují DNA sekvenování a fragmentační analýzu a navíc též syntézu oligonukleotidů
(včetně Real-Time PCR sond). Proteomické techniky pokrývají spektrum izolace, purifikace and
separace proteinů a jejich charakterizace hmotnostní spektrometrií. CL nabízí praktické kurzy. CL
je aktivním členem Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF).


Proteomické techniky

Jednorozměrná a dvojrozměrná multigelová elektroforéza (Bio-Rad)
Kapalinové chromatografy Ultimate (Dionex-LC Packings)
Hmotnostní spektrometry Reflex IV a Esquire 2000 (Bruker)
Nabízíme všechny kroky nutné ke zpracování vzorku - od izolace proteinů až po jejich charakterizaci
a bioinformatické zpracování dat. Provádíme solubilizaci vzorku, depleci abundantních proteinů,
prefrakcionaci, isoelektrickou fokusaci na imobilizovaných gradientech pH, separaci
polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (1-DE, 2-DE), barvení po separaci v gelu, image analýzu,
dále pak frakcionaci a separaci kapalinovou chromatografií, proteinovou digesci (in-gel nebo
in-solution) a MS analýzu (MALDI-TOF MS a LCMSMS).



                     Příprava vzorku (extrakce kyselina mravenčí/acetonitril)


Pomůcky

–        dostatečně narostlé overnight kultury bakterií (kvasinek, hub) (testováno – vliv media,
kultivační teploty a stáří kultury!!! – variace ve spektru, ale nikoli v sumě cca 200-300 peptidů
stabilně přítomných, podmínkami neovlivnitelných a důležitých pro identifikaci)

–        pomalurostoucí kultury – odběr po jejich narostení

–        chemikálie a plasty musí být v kvalitě pro hmotnostní spektrometrii nebo pro HPLC!! (tzn.
nejvyšší čistoty)

–        sterilní 1,5 ml Eppendorf zkumavky, sterilní 1000 μl špičky, automatické mikropipety,
sterilní deionizovaná voda, sterilní umělohmotné kličky (vyhýbat se kovům, ovlivňují spektra -
adukty), pokud odebíráme z tekutého media – sterilní skleněné pasteurky)

–        pomůcky v MALDI-MS laboratoři: čerstvě připravená matrice – HCCA v 50% ACN a 2,5% TFA
(roztok ACN/TFA – basic organic solvent)






Postup přípravy vzorku v mikrobiologické laboratoři (flowbox, vortex):


-          5-10 mg buněčného materiálu narostlé kultury rozmíchat v 900 μl sterilní DDW

-           dobře promýt buňky od media (vortex) (při použití buněk z kultivace v tekutém mediu
doporučuji dvojí promytí v DDW)

-          Centrifugovat 2 minuty při 4000-5000ot/min

-          Odpipetovat vodu po promytí buněk, dále pracujeme s peletem

-          K peletu buněk přidat 300 μl DDW a promíchat na vortexu

-          Přidat 900 μl 96 % ethanolu, promíchat na vortexu

-          Centrifugovat 2 minuty při 13 500 ot/min

-          Odpipetovat VEŠKERÝ supernatant

-          Pelet skladovat v lednici


Postup přípravy vzorku pro analýzu v laboratoři MS (kampus, budova A2):











MALDI MS analýza vzorku bakteriální kultury: