Buněčné komunikace
Buněčná komunikace
Cesta od jednobuněčných k mnohobuněčným organismům (asi 2,5 bil. let)
Dáno zejména potřebou vytvoření signálních mechanismů, které umožňují
vzájemnou komunikaci buněk, aby chování buněk mohlo být správně
koordinováno.
Selhání této kontroly – patologické stavy, např. vznik nádorového onemocnění
Organizace tkáně je zachována díky třem faktorům:
1.Buněčná komunikace – buňky kontrolují své okolí a vnímají signály od
ostatních buněk (růstové faktory, faktory pro přežití). Nové buňky vznikají
pouze tehdy a tam, kde je třeba.
2.Selektivní mezibuněčná adheze – různé buňky mají na povrchu různé
adhezívní molekuly, které mají tendence vázat se k buňkám stejného typu,
s určitými jinými buněčnými typy nebo specifickými složkami extracelulární
matrix (ECM). Zabraňuje chaotickému míchání různých buněčných typů.
3.Buněčná paměť – speciální formy genové exprese vzniklé během
embryonálního vývoje jsou stabilně udržovány – buňky si uchovávají svůj
charakter a přenášejí ho na potomstvo.
2
Chování buněk a rovnováha v buněčných populacích jsou
regulovány komplexním integrovaným komunikačním
systémem, který zahrnuje
signály mimobuněčné, mezibuněčné a vnitrobuněčné.
Živočišné buňky obsahují systém proteinů, který jim
umožňuje reagovat na signály jiných buněk.
Zahrnuje
receptorové proteiny na buněčném povrchu nebo uvnitř
buněk (v cytoplasmě nebo v jádře), proteinové kinázy,
fosfatázy, proteiny vážící se na GTP a řadu dalších
vnitrobuněčných proteinů, se kterými tyto signály
interagují.
3
Accordingto:J.E.Trosko:EnvironmentalHealthPerspectives;
106:331-339,1998
Typy komunikace: mimobuněčná (endogenní regulátory – hormony,
cytokiny, neurotransmitery, exogenní látky – potrava, chemikálie),
vnitrobuněčná (druzí poslové, přenos signálů) a mezibuněčná (gap junction
– malé signální molekuly – 1kD)
4
Typy signálů
Synaptické – nervové buňky nebo neurony, produkce
neurotransmiteru. Působí méně ve vyšších koncentracích
(5x10-4 M) a jejich receptory mají relativně nízkou afinitu ke
svým ligandům.
Endokrinní – hormony přecházejí krevním řečištěm k
cílovým buňkám. Tyto signály jsou relativně pomalé proti
nervovým signálům, působí však ve velmi nízkých
koncentracích (méně než 10-8 M)
Parakrinní – lokální ovlivňování buněk na krátké vzdálenosti
(cytokiny, eikosanoidy)
Autokrinní – buňka vysílá signál, který se váže zpětně na
její receptor. Důležité při raném vývoji a odpovědi na
diferenciační signály a u eikosanoidů.
5
Formy mezibuněčných signálů
6
Rozdíl mezi endokrinním a synaptickým
signálem
7
Autokrinní signál
8
Transdukce (přenos) signálů
Zpráva přijatá na povrchu buňky je předávána od jednoho
souboru vnitrobuněčných signálních molekul ke druhému,
přičemž každý soubor vyvolává tvorbu dalšího.
Klíčové vnitrobuněčné signální proteiny – molekulové
přepínače – jsou signálem převedeny z neaktivního do
aktivního stavu a pak zase inaktivovány
Signalizace fosforylací – aktivace kinázou a inaktivace
fosfatázou
Signalizace pomocí GTP-vazebných proteinů – aktivace převod
GDP-GTP, inaktivace hydrolýzou GTP
Nakonec je např. aktivován metabolický enzym, zahájena
exprese genu nebo změněn cytoskelet – výsledkem je
biologická odpověď buňky
9
Zjednodušené schéma vnitrobuněčné signální
dráhy aktivované mimobuněčnou signální
molekulou
10
Základní funkce signální kaskády
vnitrobuněčných molekul
Fyzicky přenášejí signál z bodu, kde byl přijat, do
buněčného aparátu, který vytvoří odpověď.
Transformují signál do molekulární podoby, která může
odpověď stimulovat.
Signální kaskády mohou přijatý signál zesilovat. Pak několik
extracelulárních signálních molekul vyvolá rozsáhlou
odpověď.
Signální kaskády mohou signál rozdělit tak, aby současně
ovlivnil několik dějů a mohl být předán různým cílům uvnitř
buňky – rozvětvený tok informace a komplexní odpověď.
Každý krok signální kaskády je otevřen působení dalších
faktorů a přenos signálu může být modulován.
11
Různé typy vnitrobuněčných signálních proteinů
účastnících se signální dráhy od receptoru na povrchu
buňky k jádru Signální proteiny a vnitrobuněčné
mediátory předávají mimobuněčný signál
do buňky a způsobují změny genové
exprese.
Mohou signály
1) Pouze předávat dál (relay)
2) Přenášet z jednoho místa buňky na jiné
(messenger)
3) Vázat navzájem signální proteiny (adaptor)
4) Zesilovat (amplifier)
5) Měnit na jinou formu (transducer)
6) Rozdělit (bifurcation)
7) Integrovat(integrator)
Kromě toho existují proteiny modulující
(modulator), ukotvující (anchorage) nebo
spojující (scaffold) signální molekuly
12
Integrace signálu
13
Dva typy vnitrobuněčných signálních komplexů
14
Vytváření stabilních a přechodných signálních komplexů
závisí na řadě vysoce konzervovaných, malých
vazebných domén nalezených u mnoha vnitrobuněčných
signálních proteinů (Src homologní 2 a 3 domény –
SH2, SH3, phosphotyrosine-binding (PTB) domény).
Některé povrchové receptory a vnitrobuněčné signální
proteiny se sdružují přechodně ve specifických
mikrodoménách lipidové dvojvrstvy plasmatické
membrány bohatých na cholesterol a sfingolipidy – tzv.
lipidové rafty. Vazby v těchto raftech pomocí kovalentně
připojených lipidových molekul podporují rychlost a
účinnost signálního procesu a usnadňují spojení a
interakce signálních molekul.
15
Membránové proteiny
Zakotvené v lipidové dvojvrstvě
regulují chování buněk a organizaci
buněk ve tkáních.
Adhezivní proteiny drží buňky
pohromadě a překlenují membránu
jednou
Receptorové proteiny překlenují
membránu jednou nebo víckrát.
Vazba signální molekuly iniciuje
odpověď na druhé straně a dochází
k přeměně jednoho typu signálu na
jiný – signální transdukce.
Tyto proteiny mají na vnitřní straně
membrány dlouhé sekvence
hydrofóbních aminokyselin
Pietzsch J et al., Nature Reviews, 2004
Model buněčné membrány
16
Fluidní mozaika – buněčná membrána je komplexní struktura složená z
různých částí – proteinů, fosfolipidů a cholesterolu. Relativní množství těchto
komponent i typy lipidů se liší od membrány k membráně.
Lipidové rafty
malé oblasti proteinů a lipidů (mikrodomény) ve vnější části
membrány s unikátním složením lipidů – bohaté na
sfingolipidy a cholesterol.
Sfingolipidy obsahují dlouhé řetězce nasycených kyselin,
jsou pevně vázány v dvojvrstvě (packing) – tvoří gelovou
fázi. Po vazbě s cholesterolem se struktura mění – tekutá
fáze – více fluidní
Tyto struktury jsou funkčně zahrnuty
v kompartmentalizaci, modulaci a integraci buněčných
signálů modulují důležité procesy jako buněčný růst, přežití
a adhezi.
Zahrnují nebo vylučují specifické proteiny.
17
Co jsou to lipidové rafty?
Pietzsch J et al., Nature Reviews, 2004
18
MK vázány na albumin
v séru
Přenos přes membránu
difúzí nebo pomocí
specifických
transportních proteinů
(FATPs).
Vazba na specifické
vazebné proteiny
(FABP), přenos na Ascl
proteiny katalyzující
reakci konvertující
volné MK na jejich CoA
deriváty.
Marszalek JR and Lodish HF, Annual Rev Cell Dev Biol 2005
Transport MK do buňky
19
Fatty Acid Translocase (FAT/CD36)
Protein v plasmatické (mitochondriální?) membráně
CD36 – multifunkční adhezní receptor pro trombospodin a kolagen a
scavenger receptor pro LDL exprimovaný na plateletech, monocytech ale i
jiných typech buněk.
Nově prokázána funkce při transportu VNMK i jeho přítomnost v buňkách
gastrointestinálního traktu (Lobo MVT et al., J Histochem Cytochem 2001,
Campbell SE et al, J Biol Chem 2004, Drover VA, J Clin Invest 2005)
20
Transport MK přes cytoplasmatickou membránu
Různé modely:
• Jednoduchá difúze
• CD36 (88kDa) a FABPpm (plasma membrane-associated fatty acid-binding protein
(43kDa) vážou MK na povrchu, zvyšují lokální konc. a usnadňují tak difúzi
• aktivní transport pomocí CD36
• Uvnitř buněk se MK vážou na cytoplasmatické vazebné proteiny (FABPc) před
vstupem do metabolických či signálních drah
• Malá část MK je transportována FABP a rychle aktivována membránovými acyl-CoA
synthetázami (ACS1) a tvoří estery acyl-CoA .
• MK s dlouhým řetězcem > C22) jsou transportovány preferenčně a přímo
konvertovány na estery acyl-CoA s velmi dlouhým řetězcem
Schwenk RW Prostagl
Leuk Ess Fatty A 2010 21
Kvantitativní srovnání přítomnosti albuminu v mimobuněčném prostoru,
fatty-acid binding proteins (FABPc) v cytoplasmě a koncentrace
mastných kyselin za fyziologických podmínek.
Albumin (3-6 vazebných míst pro MK) a FABPc (9 typů) vytvářejí
prostředí pro extrémně nízké konc. MK s dlouhým řetězcem.
Schwenk RW Prostagl Leuk Ess Fatty A 2010
22
Po dodání mastných
kyselin
jsou neutrální lipidy
syntetizovány v
endoplasmatickém
retikulu (ER), kde se tvoří
a odlučují LD tvořící
nezávislé organely
ohraničené monovrstvou
fosfolipidů a napojených
specifických proteinů.
Zásobárna energie a
zdroj signálních molekul.
Martin S. and Parton RG Nature Reviews 2006
Lipid droplets (LD)
23
Většina mimobuněčných signálů je zprostředkována hydrofilními
molekulami, které se váží na receptor na povrchu cílové buňky.
Některé signální molekuly jsou dostatečně hydrofobní nebo malé, že
snadno projdou přes plasmatickou membránu a uvnitř pak přímo
regulují aktivitu specifických vnitrobuněčných proteinů.
Např. molekuly některých plynů jako je oxid dusíku (NO) nebo uhlíku
(CO).
NO je vytvářen enzymem NO syntázou deaminací aminokyseliny
argininu. NO difunduje skrz membránu buňky, která jej tvoří a prochází
do sousedních buněk. Funguje jen lokálně, protože má krátký poločas
života, pouze 5-10 vteřin, a v mimobuněčném prostoru je přeměňován
na nitráty nebo nitrity. V mnoha cílových buňkách např. v
endoteliálních, reaguje NO s železem v aktivním místě enzymu guanylyl
cyklázy a stimuluje produkci vnitrobuněčného mediátoru cyklického
GMP.
Podobně funguje CO.
24
Oxid dusíku
NO - důležitá signální molekula pro působení acetylcholinu
uvolňovaného autonomním nervstvem ve stěnách krevních cév.
Uvolněný NO funguje jako relaxační signál a způsobuje uvolnění
hladkého svalstva ve stěnách cév.
Tento účinek NO na krevní cévy je podstatou působení nitroglycerinu,
který je již více než 100 let používán jako lék pro pacienty s anginou
pectoris trpících bolestí způsobenou nedostatečným zásobováním
srdečního svalu krví. Nitroglycerin je přeměňován na NO, který
uvolňuje svaly cév, čímž redukuje nápor na srdce a snižuje tak
požadavek srdečního svalu na kyslík.
NO je produkován také jako lokální mediátor aktivovanými makrofágy a
neutrofily a pomáhá jim zabíjet mikroorganismy.
NO je využíván řadou typů nervových buněk pro signálování sousedním
buňkám: je uvolňován např. autonomním nervstvem v penisu a
způsobuje lokální dilataci krevních cév odpovědnou za erekci.
25
Úloha oxidu dusíku (NO) v relaxaci buněk
hladkého svalstva cévní stěny
26
N
O
Hypotetické schema modulace toku signálu oxidem dusíku (NO) vedoucí ke změnám aktivace
transkripčních faktorů a genové exprese (AP-1 aktivační protein 1, ERK mimobuněčným signálem regulovaná
kináza, JAK Janus protein kináza, MKP-1 mitogenem aktivovaná protein kináza fosfatáza-1, NFkB jaderný faktor kB, O2superoxid,
ONOO- peroxynitrit, p38 p38 mitogeny aktivovaná protein kináza, PTP protein tyrosin fosfatáza, Ras malý GTPvazebný
protein, ROS reaktivní kyslíkové metabolity, RXR retionid X receptor, SAPK stresem aktivované protein kinázy)
NO, ROS,
ONOONitrosation
Oxidation Nitration Metal complexes
Plasma membrane
Protein kinases
SAPK, p38, JAK, ERK
O2 or O2-
Protein
phosphatases
MKP-1, PTP
RAS
Gene transcription
Transcription factors
NFkB, AP-1, C/EBP, Sp-1, RXR
Nucleus
27
Receptory
Většinou transmembránové proteiny, které váží mimobuněčné signální
molekuly (hydrofilní) – ligandy a jsou-li aktivovány vzniká kaskáda
vnitrobuněčných signálů, které mění chování buňky.
Vnitrobuněčné receptory (v cytoplasmě nebo v jádře) – pro malé
hydrofobní ligandy
Každá buňka mnohobuněčného organismu je exponována stovkami
různých signálů z prostředí a musí na ně reagovat selektivně.
Specifický způsob odpovědi buňky na okolí se liší podle souboru
receptorových proteinů, které buňka má, vnitrobuněčné mašinerie,
kterou buňka reaguje a interpretuje získanou informaci. Tak jedna
signální molekula může mít často rozdílné účinky na různé cílové
buňky.
Buňka reaguje na různé soubory signálů buď proliferací, diferenciací,
nebo vykonáváním specif. funkcí.
Signály pro přežití – absence signálů – programovaná buněčná smrt
28
Vazba mimobuněčných signálních molekul k
povrchovým nebo vnitrobuněčným receptorům
29
Závislost živočišné buňky na mnohonásobných
mimobuněčných signálech
30
Různé odpovědi indukované
neurotransmiterem acetylcholinem
31
Povrchové receptory
Přenašeče signálů, které přeměňují vnější podnět na jeden nebo více
vnitrobuněčných signálů.
Tři základní typy:
1) vázané na iontové kanály – pro rychlé synaptické signály el. vybuditelných
buněk – nervové buňky, neurotransmitery
2) vázané na G-proteiny
3) vázané na enzymy
Ad 1) a 2)
Po aktivaci proteinů je zahájena fosforylační kaskáda, kterou je signál přenášen
do jádra, kde se mění exprese specifických genů a tím i chování buňky
Hlavní typy proteinových kináz - serin/treoninové a tyrosinové kinázy (asi 2%
genomu).
Komplexní chování buňky jako je přežívání a proliferace jsou obecně stimulovány
spíše specifickou kombinací signálů než jedním samostatným signálem.
Buňka musí integrovat informaci přicházející s jednotlivými signály, aby mohla
příslušně reagovat - žít či uhynout, proliferovat či zůstat v klidu nebo diferencovat.
Integrace je závislá na interakci mezi různými fosforylačními kaskádami proteinů,
které jsou aktivovány různými vnějšími signály.
32
Tři typy buněčných povrchových receptorů
33
Vnitrobuněčné receptory
Proteiny regulující transkripci genů – superrodina receptorů pro steroidní hormony.
Ligandy jsou malé hydrofóbní signální molekuly - steroidní a tyroidní hormony, retinoidy a
vitamín D.
Typ I: lokalizovány v cytoplazmě v inaktivní formě (často spojeny s tzv. “heat shock
proteiny”). Po vazbě ligandu translokace do jádra.
Příklad: receptory pro steroidní hormony (glukokortikoidy, androgen, progesteron,
estrogen, dioxinový Ah receptor (vazba s proteinem Arnt)
Typ II: lokalizovány v jádře. Po vazbě ligandu konformační změny. Mohou se vázat na
DNA i bez ligandu.
Příklad: tyroidní receptory (TR), receptory pro kys. retinovou (RAR, RXR), vitamín D3
(VDR), peroxisomové proliferátory (PPAR)
Dochází k propojení drah signálové transdukce (“cross-talk”).
Tvorba homo- a heterodimerů: PPAR-RXR, TR-RAR
Aktivované receptory se váží na specifické sekvence DNA - responsivní elementy.
Dvoustupňová reakce: a) přímá indukce transkripce malého množství specifických genů
během 30 minut - primární odpověď, b) produkty těchto genů pak aktivují další geny a
vyvolávají zpožděnou sekundární odpověď.
Indukce charakteristické odpovědi u organismu:
1) jen určité typy buněk mají příslušné receptory,
2) každá z těchto buněk obsahuje různou kombinaci jiných (pro buněčný typ specifických)
geny regulujících proteinů, které spolupracují s aktivovaným receptorem a ovlivňují
transkripci specifického souboru genů.
34
Některé signální molekuly vážící se
k molekulárním receptorům
35
Superrodina vnitrobuněčných receptorů
(A) Podobná struktura receptorů s vazebnou doménou
(B) Receptorový protein v inaktivní formě vázán na inhibiční proteiny
(C) Po vazbě ligandu disociace inhibičního proteinu a navázání koaktivátoru k transkripci
aktivující doméně receptoru
(D) Trojrozměrná struktura domény vážící ligand bez a s navázaným ligandem.
Alpha helix (modře) funguje jako víčko zajišťující polohu ligandu
36
Odpovědi indukované aktivací hormonálních
receptorů
37
Pět způsobů ztráty citlivosti cílové buňky k
signální molekule
38
PPR
Důležitost PPARs v
buněčné proliferasci,
diferenciaci a
apoptóze.
Po aktivaci, PPAR a
RXR tvoří
heterodimery, které
se vážou na
regulační sekvence
cílových genů
prostřednictvím
PPRE na DNA.
Kontrola transkripční
aktivity cílových
genů PPAR vede k
biologickým účinkům
ovlivňujícím lidské
zdraví.
LTB4, leukotrien B4;
PGJ2, prostagladin
J2; PP, peroxisom.
proliferátor; PPAR,
receptor aktivovaný
PP; PPRE, responsivní
element pro
PP; 9-cis-RA, 9-cisretinová
kyselina;
RXR, receptor pro 9cis
RA.
Peroxisomové
proliferátory
(fibráty, ftaláty
apod.)
Mastné kyseliny
(PGJ2, LTB4)
Výživa
PP
Trankripce
9-cis-RA
RXR
Specifické buněčné odpovědi
Proliferace Diferenciace a zrání Apoptóza
Medical relevance
* Klonální expanze
preadipocytů
podporující
adipogenesi (účast
PPARγ.)
* Hypotetické riziko
buněčné růstové
stimulace aktivací
PPARs.
* Diferenciace monocytů /
macrofágů (podíl
PPARγ)vedoucí k
urychlené ateroskleróze
* Zvýšená exprese
PPARγ by mohla vést k
apoptóze nádorových
buněk a představuje
možný terapeutický
protinádorový přístup* Ochranné účinky
PPARα.
* Diferenciace adipocytů
odpovědná za obezitu a
další poruchy (podíl
PPARα.)
Cílové geny
RXRPPAR
39
Schéma signálních drah PPAR
L
PPAR
PPARPPAR
RXR
RXR RXR
CoRep
CoActCoRep
CoAct
CoRep?
L
PPRE PPRE
PPARs fungují jako heterodimery s jejich obvyklým partnerem – retinoidním
receptorem (RXR)
CoRep korepresor, Co Act koaktivátor,RXR receptor pro retinovou kyselinu X, PPRE responsivní element pro PP
40
(a)
IkB-závislá a -nezávislá regulace aktivity NF-kB
(a) NFkB je aktivován následně aktivaci IkB kinázy (IKK). Fosforylace těmito
kinázami vede k degradaci IkB a k translokaci NF-kB do jádra.
(b) Současně je samotný NF-kB fosforylován cytosolickými nebo jadernými
protein kinázami, které zvyšují účinnost genové exprese indukované NF-kB.
Zkratky: IkB, inhibitor NF-kB; NF-kB, jaderný faktor kB.
Aktivační signál pro NFkB
Genová exprese závislá na NFkB
Activace IkB
kináz
(b)
Fosforylace NF-kB
Konformační
změny
Fosforylace,
ubiquitinace a
degradace IkB
Jaderná translokace a vazba
NF-kB na DNA
Modulace jaderného importu, vazby na
DNA, interakce protein-protein s
koaktivátory nebo korepresory, účinky na
transaktivaci
41
Epigenetické (negenotoxické) mechanismy
karcinogeneze
Každá volba buňky zahrnuje epigenetické (negenotoxické) mechanismy,
které mohou měnit expresi genů na transkripční, translační nebo
postranslační úrovni.
Modulace mimobuněčné komunikace buď genetickou nerovnováhou
růstových faktorů, hormonů, neurotransmiterů nebo látkami z vnějšího
prostředí (dieta, chem. látky) může spustit signální vnitrobuněčnou
transdukci. Tyto signály pak modulují expresi genů a modulují též GJIC
(gap junctional intercellular communication).
V mnohobuněčném organismu zahrnuje homeostatická kontrola regulaci
buněčné proliferace, diferenciace, programované smrti a adaptivní
odpovědi diferencovaných buněk.
Když se oplodněné vajíčko vyvíjí v embryo, fetus a dospělý organismus,
totipotentní buňky jsou směrovány do pluripotentních kmenových buněk,
které proliferují, tvoří progenitorové buňky a pak diferencují, adaptivně
reagují a hynou apoptózou. Geny jsou selektivně transkribovány nebo
reprimovány během diferenciace, buněčného cyklu, zástavy buněčného
cyklu i během programované buněčné smrti. Vše jsou to děje řízené
epigeneticky.
42
mimobuněčné
podněty
hormony,
růstové faktory,
cytokiny
environm. chemikálie,
léky, záření
dietetické MK,vláknina
změny vlastností
membrány
vnitrobuněčné
signální dráhy
cytosolové receptory,
transcripční faktory
(AhR, NFκB etc.)
prooxidativní/
antioxidativní
rovnováha
jaderné receptory (PPARs, RXR, etc.)
transkripční faktory (AP-1, etc.)
acetylace/ deacetylace
histonů
metylace DNA
Změny v expresi genů
na transkripční, translační i posttranslační úrovni
Hlavní negenotoxické (a epigenetické) mechanismy zahrnuté v karcinogenezi
membránové
receptoryenzymy metabolizující
léky a hormony
RE
43