Téma P01: Diagnostika stafylokoků K nastudování: Rod Staphylococcus. (z internetu, učebnic apod.) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace. Úkol 1:Mikroskopie infekčního materiálu Popis (napište názvy útvarů a spojte je šipkami s objekty nakreslenými vlevo) V mikroskopu sledujte preparát obarvený podle Grama. Popište a zakreslete sledované útvary. Všímejte si přítomnosti bakterií (jejich tvaru, barvitelnosti a množství) dále také leukocytů, epitelií a vzájemného poměru mezi nimi. Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 2 až 7 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N Gramovo barvení – Úkol 2 Úkol 3: Kulti- vace (krevní agar) Velikost Barva Tvar Profil Hemo- lýza Jiné Úkol 4: růst na KA + 10 % NaCl Úkol 5: kataláza (pište „+“ či „–“) DÍLČÍ ZÁVĚR Úkol 6a: Test clump. faktor (+/-) Úkol 6b: Plasma-koaguláz. test (+/-) Úkol 6c: Test hyaluronidázy (+/-) Úkol 7: STAPHYtest 16 KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 2: Mikroskopie kultur mikroorganismů Kmen K Kmen L Kmen M Kmen N Obarvěte podle Grama čisté kultury předložených mikrobů. Výsledky pozorování zakreslete (↓) a zapište (↑). Úkol 3: Růst na krevním agaru Vyplňte tabulku v řádku Úkol č. 3. Do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam. Úkol 4: Růst bakterií na krevním agaru s 10 % NaCl Zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na krevním agaru s 10 % NaCl, který slouží jako selektivní půda pro stafylokoky. Zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste. Úkol 5: Katalázový test Prokažte přítomnost enzymu katalasy. Setřete mikrobiologickou kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je do kapky 3% H[2]O[2] na podložním sklíčku. Zaznamenejte reakci u všech kmenů. Do tabulky pište „+“ a „-“. Pozitivitu charakterizují _____________________, zatímco ____________________ je negativní. Nyní vyplňte řádek „Dílčí závěr“. Napište STAF, pokud se kmen ukázal býti stafylokokem, a JINÝ, pokud je to něco jiného. Úkol 6: Testy pro diferenciaci S. aureus 6a) Test na clumping faktor (test vázané plasmakoagulázy) Na podložní sklíčko kápněte kapku ředěné králičí plazmy. Pomocí sterilní mikrobiologické kličky v ní suspendujte vyšetřovaný kmen stafylokoka. Přítomnost plasmakoagulázy se projeví aglutinací bakteriálních buněk. Výsledek vyšetření zaznamenejte. Kmen ______ 6b) Plasmakoagulázový test (test volné plasmakoagulázy) Do 0,5 ml 10× ředěné králičí plazmy bylo suspendováno několik kolonií vyšetřovaného kmene stafylokoka. Suspenzi inkubujeme v termostatu při 37 °C. Výsledek se odečítá po 1, 2 a 24 hodinách. Jako pozitivní reakce se hodnotí, pokud dojde ke koagulaci králičí plasmy ve zkumavce, tj. dojde k zrosolovatění celého obsahu zkumavky, příp. alespoň části. Zapište a zakreslete výsledek této reakce u vybraných kmenů po 24 hodinách inkubace. Negativní výsledek Pozitivní výsledek 6c) Detekce hyaluronidázy Na krevní agar jsme naočkovali asi 2 cm široký pás Streptococcus equii, bakterie, která tvoří silné pouzdro s obsahem kyseliny hyaluronové. Kolmo k tomuto pásu byla naočkována čára vyšetřovaného kmene stafylokoka. Pokud je příslušným kmenem stafylokoka hyaluronidasa produkována, difunduje do okolí a do druhého dne způsobí lýzu pouzdra Streptococcus equii. To se projeví půlkruhovou zónou „ztráty slizovitosti“ v pásu naočkovaného Streptococcus equii. Zakreslete výsledek reakce u dvou kmenů (včetně pozitivní a negativní kontroly) a popište. Pozor! V tomto úkolu nejde o hemolýzu kmenů. Do obrázku ji sice – pokud ji pozorujete – můžete zakreslit, není to však pro tento úkol podstatné. Dbejte pokynů učitele a úkol provádějte až po jeho výkladu! Úkol 7: Bližší určení stafylokoků pomocí biochemického mikrotestu (STAPHYtest 16) Pro identifikací stafylokoků je určena sada biochemických testů. Podle návodu k použití odečtěte výsledky jednotlivých reakcí. Názvy testů i jejich výsledky pro jednotlivé kmeny zapište a na základě interpretačních tabulek zjistěte, o které druhy stafylokoků jde. Začátek výsledků pro první kmen máte předvyplněn. VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A K + + + – – – + + – 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 0 3 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A L + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol 8: Citlivost stafylokoků k antibiotikům Zjistěte citlivost předložených kmenů stafylokoků k vybraným antibiotikům, pomocí diskového difusního testu. Citlivost k předkládaným antibiotikům zhodnoťte na základě srovnání zjištěného průměru inhibiční zóny s příslušnou hraniční zónou. Seznam testovaných antibiotik a hodnoty jejich hraničních zón najdete v přiložené tabulce. Výsledky testu pro jednotlivá antibiotika (průměr inhibiční zóny i interpretaci) zapište. Antibiotikum (plný název, ne zkratka) S. aureus S. epidermidis Průměr zóny (mm) Interpretace Průměr zóny (mm) Interpretace Kontrolní otázky 1. Které jsou klinicky významné grampozitivní koky? Uveďte alespoň dva způsoby, jak odlišíte stafylokoky od ostatních dvou klinicky nejvýznamnějších rodů. 2. Jak odlišíme S. aureus od tzv. koagulázanegativních stafylokoků? S. aureus Koaguláza negativní stafylokoky a) orientační znaky, používané pro předběžnou diagnostiku velikost shluků v mikroskopu (menší, větší) barva kolonií hemolýza (zpravidla) b) spolehlivější rozlišovací testy (pište názvy testů); uveďte alespoň jeden, který jsme v praktiku nedělali pozitivní výsledek negativní výsledek 3. Který koagulázanegativní zástupce rodu Staphylococcus je uváděn jako častý původce uroinfekcí, zejména u mladých žen? 4. Způsobují stafylokoky spíše abscesy, nebo spíše flegmóny? Uveďte rozdíl mezi abscesem a flegmónou. 5. Které antibiotikum byste použili k léčbě stafylokokové infekce v případě a) většiny stafylokokových infekcí, například pneumonie b) stafylokokového zánětu močového měchýře c) osteomyelitidy (Vyhledejte si u jednotlivých protistafylokokových antibiotik, jak pronikají do moče a do kostí) 6. Co je to MRSA a jaké přináší problémy při terapii stafylokokových infekcí? Jaký je u MRSA mechanismus rezistence?