Téma P07
Jméno _____________________ Všeobecné lékařství Datum ___. 11. 2010 Strana 1
Téma P07: Diagnostika anaerobních bakterií
Ke studiu: Clostridium; nesporulující anaeroby (učebnice, WWW atd.)
Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, pokus na zvířeti, neutralizace
Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 4 (k postupnému vyplnění):
Kmen K L M N
Gramovo barvení – Úkol 1b
(včetně případných údajů o tvorbě spor)
Kultivace:úkol3
2
Krevní (“KA”) Růst A/N
VL agar (“VLA”) Růst A/N
VL bujón Růst A/N
Popis kolonií na KA/VLA*
KONEČNÝ ZÁVĚR (výsledek Úkolu 4 –
ANAEROtest, nebo, u ne-anaerobů,
výsledky předchozích testů)
*Použijte VLA (VL agar) u bakterií, které nerostou na krevním agaru
Úkol 1: Mikroskopie klinického vzorku a mikroskopie kmene
a) Prohlídka klinického vzorku
Prohlédněte si Gramem barvený preparát.
Pravděpodobně najdete směs různých bakterií, jak je to u
anaerobních infekcí typické: za infekci nemůže jeden
patogen, ale směs patogenů. Vedle bakterií můžete vidět
leukocyty (zejména polymorfonukleráry), případně
epitelie, tkáňovou drť a tak dále.
Nezapomeňte obrázek popsat (použijte čáry)!
b) Mikroskopie podezřelých kmenů
Anaerobní bakterie mohou být koky i tyčinky, grampozitivní i gramnegativní; v tom se neliší od jiných bakterií.
Bývají ale pleomorfnější. U rodu Clostridium je přítomnost a pozice endospor užívána jako významný
diagnostický znak. Pokuste se u jednoho z vašich kmenů (robustní G+ tyčinky) endospory najít.
Úkol 2: Anaerostat a anaerobní box
K získání anaerobiózy používáme v naší laboratoři tři způsoby:
a) pro tekuté půdy se jako bariéra médium/atmosféra používá parafinový olej (není dokonalé)
b) pevné půdy dáváme do anaerostatu, kde je kyslík chemicky nahrazen směsí plynů
c) pevné půdy lze také umístit do anaerobního boxu; anaerobní atmosféra je vháněna z bomby.
Vepište do obrázků svůj popis (anaerostat uvidíte doopravdy a spolu s anaerobním boxem také na obrázku).
________________
________________
________________
________________
________________
Téma P07
Jméno _____________________ Všeobecné lékařství Datum ___. 11. 2010 Strana 2
Úkol 3: Kultivace na agarových půdách
Popište kultivační výsledky daných kmenů na aerobních i anaerobních půdách.
a) Aerobní kultivace na krevním agaru (KA)
Napište, zda bakterie rostou či nikoli, případně též popište jejich kolonie.
b) Anaerobní kultivace na VL agaru (VL krevním agaru)
VL (krevní) agar je podobný krevnímu agaru, ale má snížený redoxní potenciál a kultivuje se v anaerostatu či
anaerobním boxu. Napište, které kmeny zde rostou a ty, které nerostly na KA, popište.
c) Pomnožení anaerobů ve VL bujónu
VL bujón se používá pro pomnožení málo početných anaerobních bakterií. Zkontrolujte přítomnost zákalu
(růstu) ve VL bujónu a porovnejte s výsledky části b).
Úkol 4: Druhová diagnostika anaerobů biochemickými testy
U kmenů určených jako anaeroby použijeme biochemický mikrotest (ANAEROtest 23 Lachema)
naočkovaný o dva dny dříve. Odečtěte podle schématu. Pozor, kódová kniha má tentokrát čtyři části,
musíte tedy najít správnou část dle výsledků mikroskopie. Výsledky sloupců „B“ a „A“ se nezapočítávají,
získáte tedy šestimístný kód za sloupce H až C.
Kmen: H G F E D C B A Kód:
1 Identifikace:
2 % pravděpodobn.:
4 Index typičnosti:
Kód
Kmen: H G F E D C B A Kód:
1 Identifikace:
2 % pravděpodobn.:
4 Index typičnosti:
Kód
Notes:
Úkol 5 Citlivost anaerobů na antibiotika
Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako G– koky a které
patří k patogenním druhům. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované
kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi
zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D).
Kmen 
Antibiotikum
(celé jméno)
zóny (mm) Interpretace zóny (mm) Interpretace
Téma P07
Jméno _____________________ Všeobecné lékařství Datum ___. 11. 2010 Strana 3
Úkol 6: Detekce toxinů klostridií
U klostridií se používají různé testy produkce toxinu.
a) Průkaz toxinu (lecitinázy) Clostridium perfringens
Clostridium perfringens tvoří specifickou lecitinázu, neutralizovatelnou
specifickou protilátkou. Polovina vaší misky je potřena protilátkou
(anti-lecitinázou), druhá potřeba není. Toxický efekt lecitinázy spatříte
jako oblast precipitace kolem kmene na žloutkovém agaru. Pravý toxin
je neutralizován antitoxinem, jiné lecitinázy neutralizovány nejsou.
Zakreslete výsledek do obrázku a přičiňte popis.
b) Průkaz toxinu Clostridium
tetani
Zakreslete (dle prezentace) obrázek
tetanické myši. Povšiměte si pozice
ocásku a končetin.
c) Detekce A a B toxinů Clostridium difficile
Pseudomembranózní kolitida způsobená toxiny Clostridium difficile je velmi nebezpečná, zejména u
hospitalizovaných pacientů. Testování se provádí imunochromatografickým testem, který již byl prováděn v
praktiku J09. Pro praxi je důležité, že na toto vyšetření je nutno zasílat kusovou stolici (NESTAČÍ výtěr z řiti).
Prohlédněte výsledek průkazu toxinů A + B Clostridium difficile ve vzorcích stolice X and Y a zapište výsledky:
Vzorek X je pozitivní – negativní Vzorek Y je pozitivní – negativní
Úkol 7: Ukázka hledání anaerobů mezi fakultativně anaerobní flórou
V praxi (především u poševních výtěrů) je často nutné hledat
anaeroby mezi jinými bakteriemi. Pro tento účel se používají
misky s disky. Amikacin je účinný proti gramnegativním
bakteriím, vankomycin proti grampozitivním; anaeroby však
bývají rezistentní. Vyznačte, na kterém místě se zpravidla
vyhledávají anaeroby, případně zaznamenejte i další nálezy.
Při této kultivaci jsou často viditelné laktobacily (drobné
šedé kolonie s viridací). Jsou mikroaerofilní, avšak naše
(nedokonalá) anaerobióza jim vyhovuje rozhodně více než
aerobní prostředí.
Kontrolní otázky:
1. Kde se v lidském těle vyskytují za fyziologických podmínek anaerobní bakterie? Jak se dostávají do
jiných tkání, kde pak způsobují záněty?
2. Jaké jsou principy odběru a transportu vzorku při podezření na anaerobní infekce?
3. Pro která klostridia je typické
a) zbaštění jejich neurotoxinu? b) neurotoxin šířící se z lokálního zánětu?
c) histotoxin vedoucí k plynaté sněti (jmenujte alespoň jedno)? d) pseudomembranózní kolitida?
4. Jmenujte alespoň tři antibiotika vhodná k léčbě anaerobních infekcí
a)
b)