Téma P 02-03: Diagnostika streptokoků, enterokoků a G+ tyčinek K nastudování: Streptococcu, Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium s (z učebnic, internetu…) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace, Neutralizace Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 1 až 6 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S T U V W Gramovo barvení – Úkol č. 1 Kultivace – úkol 2 (pište jen základní charakteristiku) Kataláza – úkol 3a Slanetz-Bartley 3b Žluč-eskulin 3c Úkol 4a: Optochin (jen viridující str.) Úkol 4b: Streptotest 16 (jen ústní strep.) Úkol 5a: PYR test (jen hemolytické s.) Úkol 5b: CAMP (jen hemolytické s.) Úkol 5c (jen nAnB) Aglutinace Úkol 8: arabinóza Úkol 9: Růst na KA při 4 °C KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a rozulište grampozitivní koky a tyčinky a gramnegativní bakterie. U grampozitivních tyčinek si také všimněte uspořádání (palisády), velikosti (drobné, robustní), případně sporulace. Nátěry jednotlivých kmenů označte na sklíčku pomocí dermografu příslušným písmenem. Výsledky zapište do tabulky. S gramnegativní tyčinkou již dále nepracujte. Úkol 2: Kultivace na krevním agaru Na miskách s krevním agarem máte všechny kmeny. Zapište vlastnosti kmenů do tabulky jen nejnápadnější znaky (velikost, barva a především úplná hemolýza / částečná / viridace / nepřítomnost hemolýzy) Úkol 3: Základní kultivační a biochemické testy – rodové určení a) Katalasový test k odlišení stafylokoků Proveďte katalasový test se všemi kmeny z prvního úkolu s výjimkou toho, který jste v tomto úkolu vyřadili. Stafylokoky jsou katalasa pozitivní, streptokoky a enterokoky negativní. Zapište do tabulky. b) Růst na Slanetz-Bartleyově agaru k odlišení enterokoků Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen dva - entetokoky. Zapište výsledek do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinovém agaru k odlišení enterokoků a listerií Na misce máte po výsečích naočkovány všechny kmeny. Rostou však jen tři. V případě G+ koků platí, že tyto kmeny patří mezi enterokoky. U G+ tyčinek by mělo jít o listerii. Zapište výsledek do tabulky. Úkol 4: Bližší určení streptokoků s viridací a) Optochinový test Máte za úkol vyhodnotit optochinový test u dvou kmenů, které jste určili jako streptokoky s viridací. Optochinový test je test, který se ničím neliší od běžného difúzního diskového testu až na to, že účinná látka (optochin) se nyní už nevyužívá léčebně. Kmen s přítomností zóny inhibice růstu kolem disku je S. pneumoniae, kmen bez zóny je „ústní streptokok“. Výsledek zakreslete a zapište do tabulky (tam stačí ve formě + / –) b) Biochemické určení „ústního“ streptokoka V tomto praktiku se neprovádí. Viz výklad učitele. (Odečítání je velmi podobné STAPHYtestu 16 z P01) Úkol 5: Určování streptokoků s částečnou či úplnou hemolýzou Tento úkol provádějte u tří kmenů, které jste určili jako streptokoky s betahemolýzou (části a, b, c); poslední část pouze u kmene, který určíte jako non-A-non-B streptokoka. a) PYR test PYR test je proužkový test, podobný oxidázovému. Při odečítání barevné reakce je však nutno asi pět minut vyčkat, pak přikápnout kapku činidla pro PYR test a poté počkat další půlminutu. Pozitivní je zčervenání otisku. Také tento test je pozitivní u S. pyogenes (a také u enterokoků). Negativní je Streptococcus agalactiae i non-A-non-B streptokoky. Poznámka: Někdejší bacitracinový test se dříve používal místo PYR-testu. Jeho princip je shodný s principem optochinového testu, jen s jiným antibiotikem. Pro nedostatečnou specificitu byl již téměř opuštěn. Vyplňte následující tabulku, včetně zakreslení výsledku PYR testu u všech tří testovaných kmenů. Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Kmen (zapište písmeno) Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní Interpretace: negativní – pozitivní b) CAMP test Poznámka: CAMP test nemá nic společného s cyklickým adenosinmonofosfátem. Nazývá se podle jmen svých objevitelů. Proto se také píše CAMP test a nikoli cAMP test. CAMP test je založen na hemolytickém synergismu mezi kmenem S. aureus produkujícím beta-haemolyzin a kmenem S. agalactiae strain. Pozitivní výsledek má tvar dvou trojúhelníkovitých zón („motýlovitý tvar“) úplné hemolýzy v místě překřížení obou kmenů. Malá zóna jiného tvaru se považuje za negativní výsledek. Negativní je jak S. pyogenes, tak i non-A-non-B streptokoky. Nakreslete svůj výsledek do obrázku (na následující stránce): c) Demonstrace aglutinačního testu k bližšímu určení zejména non-A-non-B streptokoků U kmene určeného jako streptokok non-A-non-B by se mohlo provést určení séroskupiny aglutinací. Prohlédněne si na obrázku z dataprojekce výsledek takové aglutinace a zakreslete. Poté zaznamenejte do tabulky výsledky všech částí Úkolu č. 5, a zapište do tabulky definitivní závěr (určení jednotlivých streptokoků). A B C D F G Úkol 6: Testy citlivosti na antibiotika u streptokoků Vyhodnoťte testy citlivosti (difusní diskové testy) na antibiotika u těch kmenů streptokoků, které považujete za patogeny či možné patogeny; předpokládejme pro jednoduchost, že se jedná o kmeny z horních cest dýchacích. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivost v mm. Na kartičce jsou napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Dubiózní jsou zóny, jejichž průměr právě odpovídá referenční zóně. Kmen Antibiotikum (celý název) Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Æ zóny (mm) Interpr. Úkol č. 7 Diagnostika pozdních následků streptokokových infekcí – vyšetření ASLO Na bočním stole naleznete ve vlhké komůrce destičku. Obsahuje pozitivní kontrolu a séra pacientů. Určete titry a interpretujte z hlediska rizika. (Přesné provedení bylo popsáno v jarním semestru při probírání neutralizace). Úkol 8: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus fecalis). Výsledek zapište do tabulky na první straně. b) Biochemický test k druhovému rozlišení enterokoků ze závažných klinických materiálů (je schopen najít více než ony dva nejdůležitější druhy) V závažných případech raději použijeme spolehlivější druhové určení než je orientační určení arabinosovým testem ve zkumavce. Použijeme biochemický test v plastové destičce, v našich podmínkách nejčastěji EN-COCCUStest. V tomto praktiku se neprování, měli byste však vzít na vědomí jeho existenci (může být předmětem zkoušení např. při zápočtovém testu). Úkol 9: Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Poznámka: Z praktických a časových důvodů vynecháváme testování citlivosti u enterokoků a listerií. Difusní diskový test se odečítá podobně jako u jiných bakterií. U enterokoků na MH, u G+ tyčinek zpravidla na MH s krvinkami. Kontrolní otázky: 1. Který streptokok je uspořádán ve dvojicích a jaký tvar jeho koky mají? 2. Který streptokok má pozitivní PYR test? A který celý rod G+ koků jej má pozitivní? 3. Provádí se druhové určení ústních streptokoků rutinně? Kdy má význam? 4. Proč se optochinový test (ale i normální difusní diskové testy) provádí na agaru MH s krví a ne na běžném MH agaru? 5. Lze použít CAMP test v diagnostice zlatého stafylokoka? Zdůvodněte. 6. U kterých streptokoků připadají v úvahu pozdní následky a o jaké následky se především jedná? 7. Které streptokoky způsobují infekce s kožními projevy? O jaké infekce jde? 8. Které grampozitivní tyčinky jsou sporulující? Jsou spóry vždy viditelné? 9. Co jsou to VRE a proč nás zajímají? 10. Jaké je využití Geobacillus (dříveBacillus) stearothermophilus a Bacillus subtilis v lékařské mikrobiologii? (Viz J05)